Sangre

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 517 (2023) Citar este artículo

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Dermanyssus gallinae es un ácaro hematófago que parasita aves silvestres y aves de granja. Su procesamiento notablemente rápido de la sangre, junto con la capacidad de alimentarse de sangre durante la mayoría de las etapas de desarrollo, hace que este ácaro sea una plaga altamente debilitante. Para identificar adaptaciones específicas a la digestión de una dieta rica en hemoglobina, construimos y comparamos transcriptomas de etapas del parásito hambrientas y alimentadas con sangre e identificamos transcripciones enriquecidas en el intestino medio. Notamos que las transcripciones del intestino medio que codifican cisteína proteasas se regularon al alza con una comida de sangre. Al mapear el aparato proteolítico completo, notamos una reducción en el conjunto de cisteína proteasas, homólogos faltantes para la catepsina B y C. Hemos identificado y analizado filogenéticamente tres transcripciones distintas que codifican vitelogeninas que facilitan la capacidad reproductiva de los ácaros. También mapeamos completamente las transcripciones para la biosíntesis de hemo y el sistema basado en ferritina de almacenamiento de hierro y tráfico entre tejidos. Además, identificamos transcritos que codifican proteínas implicadas en la señalización inmunitaria (vías Toll e IMD) y actividad (defensinas y proteínas que contienen tioéster), ARNi y canalización de iones (con objetivos para acaricidas comerciales como Fluralaner, Fipronil e Ivermectina). Las secuencias virales se filtraron de las lecturas de Illumina y describimos, en parte, el viroma de ARN de D. gallinae con la identificación de un nuevo virus, el quaranjavirus 1 del ácaro rojo.

Los ácaros Dermanyssus son ectoparásitos hematófagos de las aves1. El ácaro rojo de las aves de corral (D. gallinae) es una plaga global en las casas de ponedoras para la producción de huevos tanto doméstica como comercial intensiva2,3,4, parte de un mercado global importante y en constante crecimiento5. Los ácaros D. gallinae tienen un ciclo de vida muy corto, pasando de la etapa juvenil a la adulta madura en una semana. La necesidad de alimentarse de sangre en la mayoría de las etapas de desarrollo y la rápida dinámica reproductiva hacen de D. gallinae una plaga altamente irritante y problemática. Durante la alimentación con sangre, los ácaros D. gallinae pueden transmitir varios patógenos animales significativos a sus huéspedes6, incluidos algunos que son zoonóticos7. Aunque se ha encontrado una gran cantidad de virus y bacterias asociados con D. gallinae, su capacidad para actuar como vector o reservorio ha sido respaldada experimentalmente solo para unos pocos patógenos8,9,10. Esto es especialmente alarmante para la transmisión de Salmonella spp.10, que causa la salmonelosis asociada con los huevos y la enfermedad tifoidea aviar11, así como la propagación del virus de la influenza aviar A12. D. gallinae también se ha asociado con varias otras especies bacterianas y virales, con pruebas en espera de confirmación experimental de su capacidad vectorial2,10,13,14.

A pesar del conocimiento general del impacto global de la infestación de ácaros en el bienestar de las gallinas en la producción de huevos, nuestra comprensión de los procesos moleculares que permiten la alimentación rápida y repetitiva de la sangre, la digestión de la sangre, el desarrollo y la reproducción sigue siendo escasa. Estudios transcriptómicos previos describieron transcriptomas de cuerpos enteros de ácaros D. gallinae, principalmente en una etapa de desarrollo o estado de alimentación de manera específica15,16,17,18. Para aumentar aún más nuestro conocimiento, nos propusimos identificar transcritos específicos del intestino medio que codifican proteínas que son clave para una correcta alimentación y digestión de la sangre. Para lograrlo, comparamos transcriptomas recién secuenciados y ensamblados, con la selección posterior de transcritos enriquecidos en ácaros alimentados con sangre sobre ácaros no alimentados, con una clara expresión específica del intestino. Se prestó especial atención a los procesos inherentes a los alimentadores de sangre exitosos, incluida la digestión enzimática de las proteínas de la sangre del huésped, la biología del hemo y el hierro, la vitelogénesis y la inmunidad innata. Luego, los datos de RNA-seq se verificaron mediante RT-qPCR en conjuntos de cDNA preparados a partir de múltiples réplicas biológicas independientes. Además, complementamos el análisis de datos de RNA-seq con varios bioensayos, mediante los cuales se introdujeron inhibidores de molécula pequeña en el ácaro mediante alimentación de membrana ex vivo o microinyección en su hemocele para comprender la importancia de las moléculas y vías seleccionadas. Además, las lecturas de origen viral de Illumina se filtraron y se usaron para un ensamblaje parcial del viroma de ARN del ácaro.

En este trabajo se investigó la composición del transcriptoma de cuatro etapas de desarrollo de treinta individuos de ácaros D. gallinae o sus intestinos medios microdiseccionados (Fig. 1a) mediante el ensamblaje de novo de lecturas Illumina RNA-seq. Específicamente, construimos cinco bibliotecas de RNA-seq derivadas de cuerpos completos de protoninfas no alimentadas (UP, individuos hambrientos) y protoninfas alimentadas con sangre (FP), es decir, la única etapa de desarrollo que tiene individuos no alimentados y alimentados con sangre, lo que permite la evaluación de la regulación de la transcripción en respuesta a la alimentación de sangre del huésped (Fig. 1b). Estos se complementaron con deutoninfas y adultos alimentados, y intestinos medios disecados de adultos alimentados con sangre (Fig. 1b). Para cada biblioteca, se obtuvieron > 54 M de lecturas con Phred Scores de Q30 ≥ 93,90 %, y se ensamblaron en 85 117 contigs (Tabla complementaria S1). Después de su anotación, se eliminaron los contaminantes bacterianos (Tabla complementaria S2). Como los ácaros D. gallinae se alimentaron con sangre de pollo, que constaba de glóbulos blancos y rojos nucleados, el 4 % de las lecturas totales fueron de origen de pollo, de las cuales (79 %) se encontraron, como se esperaba, en el transcriptoma del intestino medio (Fig. S1 complementaria). ). Las secuencias de pollo identificadas se filtraron y excluyeron de los siguientes análisis. Un total de 18 101 contigs específicos de D. gallinae se depositaron en el servidor NCBI como BioProject PRJNA597301 y Transcriptome Shotgun Assembly (TSA) GIFZ00000000 y son accesibles a través de NCBI BLAST de la base de datos TSA. Los cóntigos también se enumeran en una hoja de Excel con hipervínculos (consulte "Disponibilidad de datos") con características de proteínas predichas codificadas disponibles, anotaciones de cóntigos ensamblados de acuerdo con una base de datos particular, estadísticas de expresión diferencial y procesos celulares previstos. Para evaluar la integridad del transcriptoma, realizamos un análisis BUSCO del proteoma, cuyo resultado mostró un rendimiento del 91,8 % de BUSCO completos. El mapa de calor generado a partir de contigs específicos de D. gallinae indicó claramente las diferencias entre los transcriptomas de las etapas inmaduras y adultas y también resaltó las diferencias en la abundancia de transcripciones en los ácaros alimentados con sangre sobre los no alimentados (Fig. S1 complementaria).

a Ilustración esquemática del flujo de trabajo experimental realizado en este trabajo. b Ilustración fotomicrográfica de individuos representativos ordenados por etapa de desarrollo.

Para identificar las transcripciones asociadas a la alimentación con sangre, hemos comparado transcriptomas de alimentados con sangre y UP (Fig. 2a), que se desarrollaron a partir de larvas que no se alimentan, es decir, una etapa de desarrollo que aún no ha entrado en contacto con la sangre. Para identificar las transcripciones que codifican proteínas clave para la alimentación de sangre de los ácaros, filtramos las transcripciones que eran al menos 16 veces más abundantes en sangre-FP que en UP. Estos totalizaron 906 transcripciones (Fig. 2a). Estas transcripciones se enriquecieron aún más para aquellas que tenían al menos un valor de FPKM de 1 en la biblioteca transcriptómica del intestino medio. De esta manera, identificamos 264 transcripciones (Fig. 2a), que creemos que codifican proteínas asociadas a la alimentación sanguínea. La ontología génica indica un enriquecimiento en la señalización, la regulación nuclear de la expresión y la proteostasis, y la matriz extracelular y la señalización comprenden las transcripciones más abundantes (Fig. 2b). Entre los transcritos con expresión más diferencial (DET) se encuentran la metalocarboxipeptidasa secretada (proteasa M14), las cisteína proteasas (Cathepsin L5 y Legumain 4), la serina proteasa (Stubble) y las glucoproteínas estructurales extracelulares, como la proteína de la cutícula, la mucina y las peritrofinas (fig. 2c). Para hacer que los valores de FPKM de expresión de la transcripción sean susceptibles de una comparación cuantitativa estadísticamente significativa, los transcriptomas se validaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) a partir de plantillas independientes de al menos cuatro réplicas biológicas (ver más abajo). El análisis de RT-qPCR confirmó la regulación de la alimentación con sangre, y la mayoría de las transcripciones se regularon significativamente en los ácaros alimentados con sangre en comparación con los ácaros no alimentados (Fig. 2c '). Para obtener más información sobre los procesos específicos del intestino medio, seleccionamos transcripciones del intestino medio expresadas diferencialmente que muestran un cambio de pliegue en los valores de FPKM de expresión del intestino medio sobre cuerpos enteros de adultos. Las transcripciones con la expresión más profunda específica del intestino medio son las que codifican proteasas, ferritina 2 (proteína de unión al hierro), ferroquelatasa (una enzima terminal de la biosíntesis del hemo) y lipoglucoproteína transportadora de hemolinfa (Fig. 2d). Estos DET se confirmaron nuevamente mediante RT-qPCR independiente (Fig. 2d '). Estos datos destacan la digestión proteolítica y la homeostasis de metales (metalostasis) como clave para el éxito de la alimentación con sangre de los ácaros D. gallinae.

a Los diagramas de Venn muestran una superposición de composición con transcripciones enriquecidas en protoninfas alimentadas >16 × valores de FPKM sobre protoninfas no alimentadas y con transcripciones de FPKM ≥ 1 en el intestino medio. b El gráfico de barras muestra las clases de proteínas codificadas por transcritos individuales enriquecidos por la alimentación con sangre. Las transcripciones se ordenaron según la clase de proteína codificada. Se muestra el número de transcripciones de cada subclase y sus valores FPKM. c La tabla muestra los mejores transcritos expresados ​​diferencialmente (DET) enriquecidos, >16 × valores de FPKM, en transcriptomas de protoninfas alimentadas con sangre (FP) sobre transcriptomas de protoninfas no alimentadas (UP). Los ID de acceso individuales están disponibles en la Tabla complementaria S3. c' Validación por RT-qPCR de DET identificados por los datos de RNA-seq que se muestran en el panel (c). Los datos se obtuvieron de conjuntos de ADNc sintetizados a partir de tres aislados de ARN independientes de ácaros no alimentados y alimentados con sangre (n = 3) y normalizados al factor de elongación 1 (ef1α). Se muestran las medias y los SEM. d La tabla muestra los DET enriquecidos en transcriptomas de intestino medio sobre transcriptomas de cuerpos enteros, con filtros aplicados: Eval < e−60, cobertura ≥ 90 %, FPKMAdults ≥ 2. Los ID de acceso individuales están disponibles en la Tabla complementaria S4. d' Validación de RT-qPCR de DET identificados por los datos de RNA-seq que se muestran en el panel (d). Los datos se obtuvieron de conjuntos de ADNc sintetizados a partir de al menos cuatro aislados de ARN independientes de hembras adultas y del intestino medio microdiseccionado de hembras adultas (n ≥ 4) y normalizados a ef1α. Se muestran las medias y los SEM. Análisis de la prueba t: *p = 0,05–0,01; **p = 0,01–0,001; ***p = 0,0008; **** p < 0,0001; ns no significativo. Para conocer los datos de origen detrás de los gráficos, consulte Datos complementarios S1.

Las proteasas del intestino medio representan claramente un conjunto enzimático importante que permite un procesamiento rápido de la sangre. Para revelar un repertorio completo del sistema proteolítico digestivo de D. gallinae, extrajimos las bibliotecas transcriptómicas e identificamos transcripciones que codifican proteasas de clanes y familias de proteasas individuales. Se descubrió que las proteasas de cisteína (principalmente la familia de la papaína) estaban codificadas por la mayoría de las lecturas del intestino medio identificadas, lo que representa ~62 % de todas las lecturas de codificación de proteasas (Figura complementaria S2). Entre las 10 cisteína proteasas identificadas, seis moléculas similares a la catepsina-l codificadas (clan CA, familia C1) y cuatro leguminosas codificadas (asparaginil endopeptidasas; clan CD, familia C13) (Fig. 3a, b). La catepsina L5 y la leguminosa 4 estaban fuertemente reguladas al alza por la alimentación con sangre y parecían expresarse principalmente en el intestino medio de adultos de D. gallinae, lo que indica su participación directa en la digestión de la sangre del huésped en el intestino medio del ácaro. Se identificaron tres aspartil proteasas (AP) de tipo catepsina-D (clan AA, A1 familia A1), con un patrón de expresión enriquecido en el intestino medio (Fig. 3b). Curiosamente, no se identificaron homólogos de las catepsinas B y C (dipeptidil peptidasa I) de las proteasas clave similares a la papaína, que participan en la digestión de la sangre en las garrapatas y otros parásitos que se alimentan de sangre19,20, en los transcriptomas de D. gallinae (Fig. 3a). Su ausencia parece ser un rasgo común entre los ácaros mesostigmados (Fig. 3a), lo que indica una aparición de alimentación de sangre en los ácaros D. gallinae en el fondo molecular de un repertorio enzimático desprovisto de catepsina B y C, es decir, enzimas que inicialmente se pensó que eran indispensable para la digestión de la sangre en especies parásitas21.

a Identificación de homólogos de proteasas digestivas en el transcriptoma de Dermanyssus gallinae (Dg) (resaltado con un rectángulo rojo discontinuo) y representantes de Chelicerates; Lp, Limulus polyphemus; Pt, Parasteatoda tepidariorum (un representante de Araneae); tu, Tetranychus urticae; Ss, Sarcoptes scabiei; Es, Ixodes scapularis; Rm, Rhipicephalus microplus; Mo, Metaseiulus occidentalis; Vd, Varroa destructor; Nc, Neoseiulus cucumeris. Los rectángulos verdes indican la presencia y los rectángulos blancos indican la ausencia de identificación homóloga con valores E de umbral establecidos en ≥1e−30. Los detalles de las configuraciones y los resultados de la búsqueda Blast se muestran en la Fig. S2 complementaria. b Una lista de proteasas seleccionadas y valores de expresión (FPKM) de sus transcritos de ARNm en bibliotecas derivadas de etapas de desarrollo individuales de D. gallinae. Los ID de acceso individuales están disponibles en la Tabla complementaria S5. Protoninfas no alimentadas UP, protoninfas alimentadas FP, deutoninfas alimentadas FD, cuerpos enteros WB. La varianza de expresión para cada transcrito se indica mediante colores que van desde bajo (azul) hasta alto (rojo).

Además de ser rica en proteínas, la sangre del huésped también es una rica fuente de hierro hemo y no hemo. La expresión específica del intestino medio de transcritos que codifican proteínas implicadas en la biología del hemo o del hierro, por ejemplo, ferroquelatasa, ferritina 2 (Fig. 2d, d'), respalda su importancia para el mantenimiento de la metalostasis en el intestino medio de los ácaros D. gallinae. A diferencia de las garrapatas, que no pueden sintetizar hemo de novo y deben tomar hemo de la hemoglobina de la sangre del huésped22, los ácaros D. gallinae mostraron claramente la capacidad de sintetizar hemo de novo. Identificamos transcripciones que codifican un perfil enzimático completo para la biosíntesis de hemo, incluida la transcripción de ferroquelatasa enriquecida en el intestino medio (Fig. 4a). Para demostrar aún más la actividad de esta vía, identificamos en homogeneizados de etapas no alimentadas de D. gallinae, productos intermedios estables de biosíntesis de hemo, ya sea por estándares (Fig. 4b) o por determinación de masa precisa (coproporfirinógeno III; Fig. S3a). El producto final de la vía, hemo b, se identificó por comparación con el estándar de hemina, con [M + 2]+ como un ion de diagnóstico dentro de su espectro de masas (Fig. S3b complementaria), lo que indica una vía biosintética de hemo completamente activa (Fig. 4c). Además, los ácaros D. gallinae producen huevos incoloros que carecen de depósitos de hemo materno (Fig. 4d), lo que favorece el concepto de biosíntesis activa de hemo sobre la distribución somática y el depósito de hemo en la dieta como se opera en las garrapatas22. Esto proporciona otra capa de evidencia de una diferencia en la biología del hemo de las garrapatas23 y los ácaros D. gallinae, a pesar de que ambos se alimentan de sangre obligatoriamente relacionados filogenéticamente.

una tabla de proteínas que participan en la homeostasis del hemo (izquierda) o del hierro (derecha), junto con sus valores de expresión (FPKM) de sus transcritos de ARNm en bibliotecas derivadas de etapas de desarrollo individuales de Dermanyssus gallinae. Los números de acceso están disponibles en la Tabla complementaria S6. UP protoninfas no alimentadas, FP alimentadas con protoninfas, FD alimentadas con deutoninfas. por desgracia, 5-aminolevulinato sintasa; pbgs, porfobilinógeno sintasa; hmbs, hidroximetilbilano sintasa; uros, uroporfirinógeno sintasa; urod, uroporfirinógeno descarboxilasa; cpox, coproporfirinógeno oxidasa; ppox, protoporfirinógeno oxidasa; fech, ferroquelatasa; ho, hemo oxigenasa; fer, ferritina; tf, transferrina; irp, proteína sensible al hierro. b El análisis de LC/MS de los precursores de Haem b en las etapas ingenuas sin alimentación de D. gallinae. Los cromatogramas reconstruidos para las muestras de D. gallinae se muestran en la parte superior, con los cromatogramas reconstruidos para sus estándares analíticos a continuación. c Un esquema de la biosíntesis del hemo, que identifica (círculos rellenos) transcritos y metabolitos de la vía. Ácido ALA δ-aminolevulínico, porfobilinógeno PBG, hidroximetilbilano HMB, uroporfirinógeno URO, coproporfirinógeno CPP, protoporfirina PP. d Una imagen fotográfica de huevos de ácaros D. gallinae y garrapatas Ixodes ricinus; observe la diferencia de color, que indica la ausencia/presencia de depósitos de hemo materno.

Al igual que las garrapatas y otros ácaros22, los ácaros D. gallinae no codifican la hemooxigenasa (Fig. 4a), una enzima que escinde el hemo y libera hierro biodisponible del anillo de porfirina. Por lo tanto, el hierro dietético adquirido debe ser de origen no hemo. Tras la absorción, el hierro es secuestrado por los aglutinantes de hierro intracelulares. Identificamos dos transcripciones de D. gallinae que codifican grandes complejos de ferritina que se unen al hierro. La transcripción de ferritina 1 (fer1) tiene un elemento sensible al hierro conservado en la región 5'UTR (Figura complementaria S4), lo que sugiere que su regulación postraduccional depende de la biodisponibilidad del hierro. Además, identificamos una segunda transcripción de ferritina (fer2) que codifica la proteína de ferritina con un péptido de señal predicho (DeepLoc: 0,77) en el extremo N (Fig. S4 complementaria), lo que indica su papel en el tráfico entre tejidos de hierro. Solo se identificó un único homólogo de transferrinas de insectos tipo 2 (melanotransferrinas) en el transcriptoma de D. gallinae (Fig. 4a).

Identificamos 7252 secuencias de codificación (65, 2%) compartidas en etapas de desarrollo (Fig. 5a), y estas representan el núcleo transcriptómico de los ácaros D. gallinae. De hecho, las etapas inmaduras (protoninfas y deutoninfas) compartieron más transcripciones entre sí que cualquiera de las etapas inmaduras con adultos (Fig. 5a). Cada etapa expresó 4.4–5.5% de transcripciones idiosincrásicas únicas (Fig. 5a). Las bibliotecas de ácaros adultos se caracterizaron por transcripciones muy abundantes que codifican proteínas que participan en el mantenimiento de la energía (arginina quinasa) y el almacenamiento/distribución de nutrientes (vitelogeninas y receptor de vitelogenina; Fig. 5b). Usando secuencias primarias de proteínas de vitelogenina 1 y 2 de I. ricinus como consultas tBlastN, identificamos, dentro del transcriptoma adulto de D. gallinae, dos transcripciones de vitelogenina que codifican los homólogos de las vitelogeninas22 de garrapatas, pero también una transcripción de vitelogenina adicional (similar a la vitelogenina 1). Las tres transcripciones mostraron claramente niveles mejorados dentro de los transcriptomas de los ácaros adultos, prácticamente sin ARNm presente en los transcriptomas de las etapas juveniles (Fig. 5b, b '). La transcripción adicional que codifica vitelogenina distinta parece ser única para los ácaros Dermanyssoidea y se indica aquí como similar a Vg1 (Fig. 5c, Tabla complementaria S8). El análisis filogenético de las vitelogeninas de artrópodos produjo varios clados de vitelogeninas que reflejan su agrupación taxonómica de artrópodos, es decir, garrapatas y ácaros parasitiformes, ácaros acariformes, arañas, escorpiones, cangrejos herradura, insectos y crustáceos (Fig. 5c). Los ácaros se dividieron en dos clados bien sustentados que contenían homólogos de Parasitiformes (ML/BI = 95/1,00) y Acariformes (ML/BI = 84/0,98). Secuencias parasitiformes agrupadas dentro de los linajes Vg1 y Vg2 bien respaldados (ambos ML/BI = 100/1,00), cada uno de los cuales comprende dos garrapatas y dos o tres homólogos de ácaros. El ácaro D. gallinae Vg1 (transcripción IrSigP-350331_FR2_207-2055, ID de proteína: MBD2876257.1), similar a Vg1 (transcripción IrSigP-349783_FR3_1-1870, ID de proteína: MBD2876000.1) y Vg2 (Dg-9795_FR3_189-2089, Proteína ID: MBD2876256.1) agrupados con sus respectivos ortólogos de vitelogenina de ácaros dentro de los linajes Vg correspondientes (Fig. 5c).

a Los diagramas de Venn muestran las idiosincrasias transcriptómicas específicas de la etapa, así como el núcleo transcriptómico compartido a lo largo de la ontogenia. b La tabla muestra las mejores transcripciones enriquecidas en transcriptomas de ácaros adultos. Estos fueron filtrados por valores >16× FPKM en el transcriptoma de adultos sobre los transcriptomas de ambos estadios juveniles de ácaros, protoninfas y deutoninfas; y valor E < e−80; las identificaciones de proteínas están disponibles en la Tabla complementaria S7. b' Validación de RT-qPCR de DET identificados por los datos de RNA-seq que se muestran en el panel (b). Los datos se obtuvieron de conjuntos de ADNc sintetizados a partir de tres aislados de ARN independientes de ácaros adultos y juveniles (n = 3) y normalizados al factor de elongación 1 (ef1α). Se muestran las medias y los SEM. Para conocer los datos de origen detrás del gráfico, consulte Datos complementarios S1. FP alimentaba protoninfas, FD alimentaba deutoninfas. c Filogenia de máxima verosimilitud de 94 secuencias de aminoácidos de vitelogenina de artrópodos que muestra el posicionamiento de tres homólogos de vitelogenina de D. gallinae dentro de los linajes Vg1 y Vg2. Las vitelogeninas de crustáceos se utilizaron como grupo externo. Los soportes nodales en los nodos principales están representados por valores de arranque de máxima verosimilitud y probabilidades posteriores de inferencia bayesiana, respectivamente. Para simplificar, los homólogos de taxones no parasitiformes se colapsaron en triángulos; los números dentro del triángulo indican el número de secuencias incluidas en cada clado. Para los números de acceso de GenBank, consulte la Tabla complementaria S8.

Para evaluar si los ácaros D. gallinae transmiten el estado de alimentación a través de una cascada de transducción mediada por TOR, utilizando homólogos de Caenorhabditis como secuencias de consulta24, hemos extraído nuestros transcriptomas e identificado la expresión del sistema TOR-complejo y la señalización de insulina/IGF25 que se expresan a lo largo de las etapas de desarrollo ( Figura complementaria S5a). Además, evaluamos el impacto de la señalización mediada por TOR en la viabilidad posterior a la alimentación de los ácaros, utilizando un sistema de alimentación de membrana ex vivo26, al alimentar a los ácaros D. gallinae adultos con sangre de pollo suplementada con Torin2, un inhibidor de los complejos TOR27. Los datos resultantes muestran que Torin2 causó una clara letalidad posterior a la alimentación con sangre dependiente de la dosis a una dosis alta de inhibidor (Fig. S5b complementaria), lo que indica una posible actividad posterior a la alimentación de esta vía en ácaros adultos.

La mayoría de los acaricidas disponibles en el mercado, así como los insecticidas, se dirigen al sistema nervioso de los invertebrados, generalmente mediante la interacción con un sitio alostérico de receptores ionotrópicos, también llamados canales iónicos controlados por ligandos (LGIC)28. Los miembros de esta familia tienen un alto grado de similitud de secuencia primaria, formando un sitio de unión de ligandos para moléculas de neurotransmisores y un poro conductor de iones. Los LGIC se pueden clasificar en cuatro familias principales29, una de las cuales implica una serie de objetivos acaricidas/insecticidas validados, es decir, la familia pentamérica cys-loop, que comparte un motivo muy característico, un bucle cys de 15 aa en el extremo N de la proteína30, 31 Los receptores cys-loop (cysLGIC) son permeables a los cationes, como los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR)32, los receptores de serotonina y también los receptores que conducen aniones, como los canales iónicos dependientes del ácido γ-amino butírico (GABA)33, la glicina receptores y canales de cloruro activados por glutamato (GluCls), histamina34,35 o zinc36. Los dos últimos, canales de cloruro activados por histamina y zinc, no se identificaron en el transcriptoma de D. gallinae (Datos complementarios S2). A diferencia de algunos canales iónicos activados por ligandos pentaméricos, los homólogos de los receptores RDL (resistencia a la dieldrina)-GABA28 y GluCl son exclusivos de los invertebrados37. RDL-GABA y GluCls pueden ser objeto de moduladores negativos, como Fipronil, o moduladores positivos, como Ivermectin38. Hemos extraído nuestro transcriptoma (E-value < e−10, usando Pediculus sp.39 y Tetranychus sp.40 como consultas) y reconstruido un árbol filogenético de receptores cys-loop, habiendo identificado 29 miembros codificantes de transcripción del cys-loop familia (Fig. 6a). Las transcripciones de D. gallinae se agruparon con sus respectivos homólogos de artrópodos y vertebrados en nueve clados y en un clado adicional que unía exclusivamente las proteínas similares a canales de cloruro activadas por glutamato específicas de Acari. Al observar la relación intestino medio/cuerpo entero, filtramos cuatro transcritos más con una presencia de transcritos de ARNm enriquecidos en el intestino medio (Fig. 6b), uno que codifica la proteína del canal de cloruro sensible al pH y tres que codifican proteínas similares al canal de cloruro específicas de Acari . A continuación, identificamos cuatro transcripciones que codifican GluCl, dos de las cuales mostraban una expresión específica del intestino medio (Fig. 6c), pero todas las transcripciones compartían un núcleo de GluCl con la región Cys-Loop y en su mayoría cuatro dominios transmembrana (Suplementario Fig. S6). El análisis de la secuencia de aminoácidos de GluCls demostró la conservación de la mayoría de los residuos de aminoácidos necesarios para la asociación de ivermectina con el canal alfa de C. elegans GluCl41 (Fig. S6 complementaria). El ensamblaje de los cuatro homólogos de GluCl fue respaldado por múltiples lecturas, excepto por el extremo C codificado de la transcripción IrSigP-571488, que se compone de lecturas asignadas de manera única (Fig. S7 complementaria). Para confirmar la sensibilidad de los ácaros D. gallinae a los acaricidas dirigidos a los canales de GluCl, como lo ejemplifican el fipronil, la ivermectina y el fluralaner, determinamos experimentalmente la supervivencia dependiente de la dosis después de la microinyección de los compuestos respectivos en ácaros adultos (Fig. 6c') . Mientras que la ivermectina y el fluralaner provocaron claros efectos letales en un par de días tras la microinyección de una solución de 10 µM, el fipronil solo causó una letalidad insignificante incluso cuando se inyectó a 100 µM (Fig. 6c').

a Árbol filogenético de máxima verosimilitud de las secuencias de proteínas de la subunidad cysLGIC de artrópodos y vertebrados. Los soportes de arranque por encima del 50 % se muestran en los nodos principales. Dermanyssus gallinae: Dg e IrSig (indicadas en rojo), Tetranychus urticae: Tu, Drosophila melanogaster (D u otra), Apis mellifera (Amel), Tribolium castaneum (Tcas), Homo sapiens (Hs), Danio rerio (Dr), Bos taurus (Bt), Equus caballus (Ec), Sus scrofa (Ss) y Gallus gallus (Gg). Para los números de acceso, consulte Datos complementarios S1. b Valores de FPKM de los canales de cloruro (Cls) individuales específicos de Acari (Ac) y dependientes del pH (pH) y su relación intestino medio/cuerpo entero (WB) de ácaros adultos. UP protoninfas no alimentadas, FP alimentadas con protoninfas, FD alimentadas con deutoninfas. c Valores de FPKM de GluCl individuales y su relación intestino medio/cuerpo entero de ácaros adultos. c' Ensayos de viabilidad dependiente de la dosis después de la microinyección de agonistas de GluCls disueltos en DMSO y diluidos al 1% del solvente. Cada punto de datos representa una media y SEM de n = 24 o 25 ácaros por concentración probada. Para conocer los datos de origen detrás de los gráficos, consulte Datos complementarios S1.

La inmunidad innata está muy conservada en los metazoos, tanto en vertebrados como en invertebrados42. La parte humoral de la inmunidad de los invertebrados comprende la detección de microbios extraños, seguida de la transducción de señales, principalmente a través de las vías de señalización Toll e Imd que funcionan, hasta cierto punto, de forma independiente43. En nuestro trabajo, extrajimos el transcriptoma de D. gallinae y reconstruimos una vía Toll completa, lo que sugiere una funcionalidad completa en D. gallinae (Fig. 7a). Los únicos componentes que faltaban eran las proteínas de unión a bacterias gramnegativas (GNBP) y el factor de transcripción DIF. Las proteínas de reconocimiento de peptidoglicano (PGRP) estaban presentes en dos variantes diferentes con clasificación incierta. Se identificaron nueve proteínas Spätzle y ocho receptores Toll. La ruta de Imd se redujo significativamente, ya que faltaban la mayoría de los componentes, incluidos IMD y Relish. Las defensinas son probablemente los péptidos antimicrobianos de 3-5 kDa más difundidos, ampliamente distribuidos en los reinos animal y vegetal44 y son moléculas efectoras reguladas por las vías Toll e IMD45. Buscamos moléculas similares a las defensinas en el transcriptoma de D. gallinae utilizando datos del genoma de la garrapata Ixodes scapularis que codifica múltiples moléculas relacionadas con las defensinas, divididas en dos familias principales: (i) escapularisinas, estructuralmente relacionadas con las antiguas defensinas de tipo invertebrado y (ii) scasins, que solo están lejanamente relacionados con las defensins canónicas46. Si bien no pudimos encontrar ninguna transcripción relacionada con la scasina de I. scapularis (Gen Bank EEC18782), identificamos varias moléculas similares a la defensina relacionadas con las escapularisinas con la mayor homología mostrada con la escapularisina-6 (GenBank EEC08935) anotadas como defensina-2 en el genoma de I. scapularis (VectorBase ISCW005928). Las secuencias de ocho transcritos de D. gallinae que codifican defensinas putativas alineadas con escapularisina-6 (Fig. 7b) revelaron que las defensinas de D. gallinae podrían dividirse en dos tipos principales: (i) defensinas de tipo I que carecen del motivo de escisión de furina canónica (RVRR)47 y (ii) defensinas de tipo II que tienen el sitio de furina conservado. Según los valores de FPKM, las defensinas tipo I parecen estar mucho más expresadas en todas las etapas (Fig. 7b).

Se utilizaron secuencias de proteínas de las vías Toll e Imd de Drosophila o Tribolium para buscar en nuestra base de datos de proteínas traducidas de D. gallinae (BLAST local, valor E 0,1, Matrix BLOSUM62). La conservación de los dominios se comprobó mediante CD-search (NCBI). Solo las secuencias homólogas con estructuras de dominio similares y un valor E < 10e−3 se consideraron homólogos putativos. Los números de acceso están disponibles en la Tabla complementaria S9. b Alineación de secuencias múltiples de defensinas maduras de D. gallinae identificadas, homología con la garrapata Ixodes scapularis scapularisin-6 (GenBank EEC08935) y valores de expresión (FPKM) de transcripciones de defensina en bibliotecas derivadas de etapas de desarrollo individuales de D. gallinae. Los residuos de aminoácidos del sitio de escisión de furina se muestran en letras rojas. UP protoninfas no alimentadas, FP alimentadas con protoninfas, FD alimentadas con deutoninfas.

El papel principal en la inmunidad innata celular y humoral de los vertebrados, así como de los organismos metazoarios de los invertebrados, lo desempeña el sistema complejo del complemento48. Las moléculas efectoras centrales de los sistemas del complemento de vertebrados e invertebrados son proteínas que pertenecen a la familia de proteínas que contienen tioéster (TEP), anteriormente denominadas proteínas de la superfamilia de macroglobulina α248,49,50. En los invertebrados, la familia TEP está formada por hasta cuatro grandes grupos filogenéticamente distintos que comprenden inhibidores de panproteasa del tipo α2-macroglobulina (α2M), componentes del complemento similares a C3 (C3), TEP de tipo insecto (iTEP) y macroglobulina. -relacionadas con el complemento (MCR)51,52,53.

Aquí, examinamos el transcriptoma de D. gallinae con secuencias completas de nueve miembros bien anotados de la familia TEP de I. ricinus que representan los cuatro grupos de TEP de invertebrados52,54. La extracción de BlastP y los siguientes análisis filogenéticos con otros representantes seleccionados de TEP de invertebrados revelaron que D. gallinae expresaba solo una molécula de macroglobulina α2, que estaba codificada por al menos cinco variantes de empalme (DgA2M (sv1–5) (Figura complementaria S8 ) dentro de la 'región cebo' sensible a la proteasa. Además, el transcriptoma de D. gallinae contenía una molécula claramente perteneciente al TEP de tipo insecto (DgTEP), una molécula similar al complemento C3 (DgC3) y tres moléculas pertenecientes al grupo de proteínas relacionadas con el complemento de macroglobulina (DgMCR-1,2,3) (Figura complementaria S8). DgMCR-3 parece ser filogenéticamente bastante distante de los otros dos, DgMCR-1 y DgMCR-2, sin embargo, su membresía dentro de los MCR están respaldados por su posicionamiento filogenético estable dentro del clado MCR y por la presencia del dominio del receptor de lipoproteínas de baja densidad característico en la parte central de la molécula 52, 54. En conjunto, D. gallinae posee representantes de todos los grupos principales de TEP de invertebrados , la mayoría de los cuales muestran diferencias sustanciales en su patrón de expresión (Figura complementaria S8).

Los artrópodos55, al igual que los organismos superiores56, están armados con un mecanismo de inmunidad antiviral basado en ARN llamado ARN de interferencia (ARNi). Esta vía es funcional contra virus de ARN y ADN en insectos57,58. Tanto las predicciones in silico como la validación experimental respaldan la presencia de una vía de ARNi funcional en D. gallinae59. Confirmamos (Fig. S9 complementaria) el análisis in silico59 e identificamos la mayoría de las transcripciones que codifican componentes proteicos de ARNi, con la excepción de un homólogo de R2D2 (corte de Eval <0.00001; consulta Drosophila R2D2: NP_001285720.1). Se informa que R2D2, una proteína de unión a dsRNA, es esencial para la carga de siRNA en los complejos efectores Ago-RISC60. Esto está en línea con un análisis filogenético integral que determinó la existencia de homólogos de R2D2 solo en órdenes de insectos alados (Pterygota) pero su ausencia en artrópodos que no son insectos (garrapatas, ácaros, crustáceos)61.

Como parte de nuestro objetivo de caracterizar el componente de ARN completo de D. gallinae, orientamos nuestra búsqueda utilizando una tubería estándar de descubrimiento de virus de artrópodos para detectar posibles secuencias virales en nuestras muestras de ARN-seq de ácaro rojo. La presencia de secuencias virales en bibliotecas de UP (no expuestas a la alimentación con sangre del huésped) o del intestino medio diseccionado (tejido interior diseccionado) demostró un viroma genuino de D. gallinae, que consiste en virus tipo picorna del ácaro rojo, densovirus del ácaro rojo, virga del ácaro rojo. como virus, ciclovirus asociado al ácaro rojo, hipovirus asociado al ácaro rojo y cistovirus asociado al ácaro rojo (Fig. 8a). Además, se identificaron varias transcripciones putativas con una homología significativa con las proteínas virales, como la de una transcripción de 1,5 kb con semejanza a la proteína hemaglutinina (HA) del virus Wellfleet Bay (WFBV, 33,85 % de identidad, valor E 9e−96) ( Figura 8a). En búsquedas adicionales de tblastN utilizando todas las proteínas de quaranjavirus disponibles como consultas, detectamos cuatro transcripciones adicionales que se asemejan a todos los segmentos típicos del genoma central de los ortomixovirus. Esto incluía una secuencia homóloga a una transcripción de 1,8 kb de la nucleoproteína (NP) del quaranjavirus Quaranfil (QRFV, identidad 30,20 %, valor E 6e-57). Además de estas proteínas estructurales, encontramos tres transcritos que van desde 2,4 kb a 2,5 kb con mejores resultados en las proteínas de la subunidad de la polimerasa de ARN dependiente de ARN multipartito PB1 (virus Tjuloc, identidad 50 %, valor E 0), PB2 (QRFV, identidad 28,90 %, valor E 9e-94) y PA (virus Tjuloc, identidad 50 %, valor E 0). Estas transcripciones se pulieron y seleccionaron utilizando las lecturas filtradas de cada biblioteca para generar secuencias de consenso de cada segmento del genoma, respaldadas por una cobertura media que oscila entre 13,5 × y 47,5 ×. Los segmentos putativos del genoma del tamaño esperado se anotaron aún más y, como se anticipó, cada uno presentó un solo ORF en su cadena de ARN + complementaria que codifica las proteínas estructurales y funcionales de un quaranjavirus típico, flanqueado por regiones no traducidas (Fig. 8b). Las proteínas de subunidad de polimerasa traducidas PB1, PB2 y PA se presentaron con dominios conservados Flu_PB1 (pfam00602, valor E 3.62e−60), Flu_PB2 (5D98_F, valor E 8.2e−121) y Flu_PA (4WRT_A, valor E 4.9e −97), respectivamente. El NP mostró un dominio Flu_NP (3TJ0_B, valor E 7.5e-81), y la proteína HA de superficie putativa albergaba un dominio típico de glicoproteína de envoltura gp64 de Baculovirus (Bac_gp64, valor E 4.64e-48), un péptido señal (SP) en el extremo N para el paso transmembrana y un dominio C terminal. Luego, examinamos las diversas bibliotecas de D. gallinae para evaluar la presencia de los segmentos del genoma que se detectaron en todas las bibliotecas siguiendo patrones de expresión simétricos, basados ​​en FPKM y respaldando la posibilidad de que los segmentos correspondieran al mismo virus (Fig. 8a). Como era de esperar, los valores de expresión de los segmentos estructurales fueron más altos que los no estructurales en cada biblioteca, lo que es una evidencia indirecta de infección activa (Fig. 8a). Con base en estos datos genómicos, distancia genética, anotación funcional y estructural y perfiles de expresión, sugerimos que estos segmentos del genoma corresponden a un virus nuevo; un miembro putativo de una nueva especie dentro del género Quaranjavirus que tentativamente llamamos Quaranjavirus 1 del ácaro rojo (RMQV1). Para considerar esta hipótesis, generamos conocimientos evolutivos basados ​​en el análisis filogenético de las proteínas PB1 y NP de RMQV1 y diversos ortomixovirus. El árbol resultante indicó claramente que RMQV1 se agrupaba dentro del clado de quaranjavirus (Fig. 8c). En resumen, se detectó y caracterizó un viroma del ácaro rojo diverso y complejo para D. gallinae, incluidas nuevas especies virales de varias familias de virus, que tienen efectos potencialmente importantes en la biología y la salud de sus huéspedes. Se justifican futuros estudios destinados a determinar los efectos epidemiológicos, ecológicos y veterinarios de estos virus.

a Segmentos virales identificados y sus respectivas abundancias de genes en bibliotecas derivadas de etapas de desarrollo individuales de D. gallinae. UP protoninfas no alimentadas, FP alimentadas con protoninfas, FD alimentadas con deutoninfas. b Gráficos del genoma que representan segmentos del genoma y productos génicos predichos del quaranjavirus 1 del ácaro rojo. Los rectángulos negros indican secuencias de codificación de ORF, los rectángulos grises predicen proteínas y los rectángulos gris claro indican coordenadas de dominios estructurales o funcionales. Las abreviaturas se describen en el texto principal. (Panel derecho) Valores de expresión para segmentos identificados de quaranjavirus del ácaro rojo. c Árbol filogenético de máxima verosimilitud basado en la alineación de las proteínas PB1 y NP predichas del quaranjavirus 1 del ácaro rojo (asterisco) y virus relacionados. Las etiquetas de rama representan los valores de soporte de FastTree. La barra de escala representa las sustituciones por sitio.

La alimentación con sangre ha evolucionado varias veces en Acari62. Los artrópodos que se alimentan de sangre muestran una capacidad notable para la proteólisis rápida de la sangre del huésped, que es una fuente muy rica de proteínas (90% del peso seco). Se sugirió que el aparato hemoglobinolítico en sus tractos digestivos se comparte entre los parásitos que se alimentan de sangre relacionados filogenéticamente y se destacó como objetivos antiparasitarios prometedores63. Aunque las garrapatas y los ácaros dermanyssoid pertenecen al mismo orden Acarina (clase Arachnida), y ambos representan ectoparásitos que se alimentan de sangre, los datos obtenidos aquí apoyan la hipótesis de la aparición independiente de la alimentación de sangre. Esto se corrobora por sus claras diferencias en la maquinaria proteolítica digestiva. Si bien tanto las garrapatas duras (I. ricinus) como las blandas (Ornithodoros moubata) dependen de la catepsina B como la principal peptidasa hemoglobinolítica64, lo que también es válido para los ácaros acariformes65, no identificamos ningún tipo de catepsina B o catepsina C que codifique la proteasa. transcripciones en transcriptomas de D. gallinae (ácaros Mesostigmata). El aparato proteolítico de digestión de sangre de los ácaros D. gallinae parece depender principalmente de proteasas lisosomales ácidas (legumain, catepsina L y catepsina D), que representan la mayoría de todas las lecturas de codificación de proteasas en el intestino medio adulto de D. gallinae. Este hallazgo confirma la observación anterior, mostrando una clara capacidad del homogeneizado de D. gallinae para digerir hemoglobina a pH ácido, siendo inhibida la actividad por E-64 y pepstatina A, indicando la participación de cisteína y proteasas aspárticas66. Se sabe que la catepsina L digestiva de la garrapata (IrCL1) muestra claras actividades hemoglobinolíticas y albuminolíticas, con un pico a pH 3,5, lo que indica su modo ácido de operación dentro de las vesículas endolisosomales de las células intestinales de la garrapata67. Por lo tanto, es razonable especular que la participación de las proteasas de catepsina L de D. gallinae podría servir en el proceso biológico análogo de la digestión de proteínas de la sangre del huésped, posiblemente también dentro de los lisosomas ácidos intracelulares. Además, las transcripciones de Cathepsin L5 y Legumain 4 muestran una clara regulación ascendente específica del intestino medio con la alimentación de sangre de manera similar a las garrapatas68, lo que indica su participación directa en la digestión de las proteínas de la sangre del huésped. Sin embargo, un mapeo detallado de las actividades proteolíticas presentes en el intestino medio de D. gallinae, basado en sustratos e inhibidores específicos, sigue siendo un desafío experimental para las próximas investigaciones en el campo. En resumen, después de menos de una hora de alimentación en el huésped69, tiempo durante el cual los ácaros aumentaron su peso corporal ~ diez veces70, siguió una rápida digestión fuera del huésped. En el pariente cercano del ácaro dermanyssoid Ornithonyssus sylviarum, aproximadamente la mitad del contenido de eritrocitos absorbidos se digirió en 4 a 8 h71. Al igual que las garrapatas y los ácaros acariformes72, los ácaros parasitiformes que se alimentan de sangre (D. gallinae)66 parecen digerir la sangre del huésped intracelularmente, utilizando un complejo multienzimático de enzimas proteolíticas endolisosomales principalmente ácidas, pero carecen de homólogos de catepsina B y C.

Ahora está claro que los ácaros D. gallinae codifican para la biosíntesis completa del hemo. Sin embargo, la heterogeneidad de los perfiles de expresión de las transcripciones individuales que codifican las enzimas biosintéticas del hemo no identifica completamente en qué etapa de desarrollo podría estar activa la vía biosintética, mostrando muy poco de un patrón de expresión dependiente de la etapa de desarrollo o del estado de alimentación. Se demostró que la transcripción que codifica la ferroquelatosa, la última enzima biosintética del hemo, está significativamente enriquecida en el intestino medio, de manera similar a las garrapatas parcialmente alimentadas73, lo que plantea la cuestión de la necesidad de esta enzima en este espacio y tiempo, ya que el tejido está inundado por copiosas cantidades de hemo. Dada la falta de depósitos de hemo en los huevos de D. gallinae, el hemo adquirido de la madre probablemente no desempeñe un papel clave en la embriogénesis y la reproducción, como lo hace en las garrapatas22. Esto también se evidencia claramente por la falta de color en los huevos depositados, que contienen niveles estimados de subpicomol de hemo b por mg de muestra rica en huevos; esto contrasta marcadamente con aproximadamente un nanomol de hemo b depositado en los huevos de las garrapatas22.

De manera similar a las garrapatas74,75, D. gallinae parece contener dos genes de ferritina separados que codifican ferritinas citosólicas y secretadas. La expresión de transcritos que codifican ambas ferritinas en D. gallinae indica su papel clave en la homeostasis del hierro en su intestino medio. Suponemos que la ferritina 1, que posee el elemento sensible al hierro en su UTR 5 'y carece del péptido señal, funciona como una proteína de almacenamiento de hierro intracelular. La ferritina secretora 2, por el contrario, tiene una clara secuencia de señal N-terminal, lo que sugiere su papel en la exportación de hierro desde el intestino medio y, por lo tanto, facilita la distribución somática del hierro adquirido en el intestino medio similar a las garrapatas y los insectos75,76. Ambas ferritinas de D. gallinae poseen un centro de dihierro ferroxidasa conservado (que facilita la oxidación rápida de Fe2+ a Fe3+), así como un centro de nucleación de ferrihidrita (que promueve la nucleación y el almacenamiento de Fe3+); estos representan motivos distintivos para las ferritinas de cadena pesada (H) y cadena ligera (L), respectivamente. Por lo tanto, las ferritinas de D. gallinae son aparentemente híbridos de los tipos H y L, de manera similar a lo demostrado experimentalmente para la ferritina de crustáceos77 y lo informado para las ferritinas de garrapatas 1 y 278. Los estudios de ARNi realizados por otros demostraron que ambas ferritinas eran esenciales para la supervivencia y reproducción de Ácaros D. gallinae79. La ferritina secretora (indicada como Dg-Fer1 en ese estudio) también ha demostrado ser un objetivo potente que confiere protección mediada por anticuerpos contra los ácaros D. gallinae en gallinas cuando se usa como antígeno recombinante79. La fuente dietética de hierro, que carga tanto la ferritina citosólica como la secretora, no está clara. Sin embargo, en D. gallinae, dada la ausencia de codificación genética para la hemooxigenasa, una enzima que libera hierro del anillo de porfirina del hemo, el conjunto biodisponible de hierro probablemente se adquiere de la transferrina de la sangre del huésped, como se determinó experimentalmente para las garrapatas22,80.

Las vías de detección y señalización inmunitarias Toll e IMD, así como los inductores inmunitarios, se reconstruyeron aquí en función de la presencia/ausencia de homólogos conocidos. Si bien pudimos minar la vía Toll completa, la vía Imd se redujo significativamente y faltaron componentes clave, como IMD y Relish. Los miembros retenidos identificados en los ácaros D. gallinae, que también están integrados en la vía IMD de los insectos, fueron caspasa (DREDD, proteASE específica de ASPartyl dependiente de cisteína) y serina/treonina quinasa (TAK1 e IKKβ). La ausencia (no identificada en nuestro transcriptoma, ni en el genoma con un corte de Eval = 0,0001) de un componente crítico de la vía, el factor de transcripción Relish, indicó la no funcionalidad de la vía IMD en los ácaros D. gallinae, similar a los ácaros filogenéticamente relacionados, Varroa (Parasitiformes; Eval cut off < 10e−3) y Metaseiulus (Acariformes)81. La extracción del transcriptoma de D. gallinae en busca de componentes del sistema del complemento primordial, representado por proteínas que contienen tioéster, reveló que este ácaro, al igual que otros quelicerados como las garrapatas, las arañas e incluso el cangrejo herradura51,52,82,83, posee todos los principales grupos de TEP, a saber, α2-macroglobulina, componente del complemento similar a C3, TEP de tipo insecto y macroglobulina relacionada con el complemento (MCR). Sin embargo, algunos de estos grupos aparentemente se perdieron durante la evolución, por ejemplo, moléculas similares a C3 de crustáceos y hexápodos o α2M de algunos linajes de insectos como moscas de la fruta o mosquitos51. El único α2M que se encuentra en el transcriptoma de D. gallinae se diversifica dentro de la "región cebo" mediante corte y empalme alternativo, presumiblemente para ampliar la cartera de proteasas diana inhibidas por el mecanismo de atrapamiento molecular84, como se informó anteriormente para la garrapata α2Ms85,86.

Además del polvo de dióxido de silicona, los antiparasitarios sintetizados químicamente se utilizan en la puesta comercial de huevos para controlar las poblaciones de ácaros D. gallinae. La mayoría de los acaricidas comercialmente exitosos se dirigen a los canales de cloruro activados por iones, lo que lleva a la limitación o eliminación de los ácaros D. gallinae en las naves avícolas87. Usando microinyección de acaricidas comerciales seleccionados suspendidos en DMSO y posterior dilución 100x con PBS estéril, evaluamos la supervivencia dependiente de la dosis de los ácaros D. gallinae. Si bien pudimos ver una clara letalidad dependiente del tiempo y la dosis de los ácaros después de la microinyección de fluralaner e ivermectina, de manera similar a estudios previos que explotaron una vía de administración diferente87,88, no observamos el efecto acaricida del fipronil administrado a través de microinyección. . Esta observación puede estar en línea con la menor y heterogénea sensibilidad reportada previamente de los ácaros D. gallinae a la exposición tópica a la solución de Fipronil89. Si bien no tenemos conocimiento de los canales de cloruro específicos de Acari, cada vez hay más trabajo disponible sobre los canales de cloruro sensibles al pH en otros invertebrados. Curiosamente, el canal de cloruro sensible al pH de Bombyx mori es sensible a la ivermectina, pero no responde al fipronil90, lo que recuerda a nuestros datos de ensayos de viabilidad tras la microinyección de agonistas. Esto puede sugerir que los canales de cloruro dependientes del pH podrían ser objetivos clave para los agonistas de canales como la ivermectina para provocar actividad acaricida.

D. gallinae es una plaga avícola global y altamente debilitante. Con fundamentos seminales recientes17,26,91 para su comprensión molecular detallada, podrían identificarse y validarse nuevos objetivos acaricidas, posiblemente inherentes a los ácaros que se alimentan de sangre. Aquí, hemos secuenciado y ensamblado nuevos transcriptomas de D. gallinae, comparando ácaros alimentados con sangre y no alimentados, así como cuerpos completos y intestinos medios microdiseccionados. Estos representan conjuntos de datos informativos clave que permiten comprender las adaptaciones moleculares de este ectoparásito a su estilo de vida obligatorio de alimentación de sangre. También nos proporciona un catálogo de objetivos potenciales adecuados para el desarrollo de acaricidas basados ​​en objetivos. Las secuencias de contigs ensamblados, anotaciones y valores de expresión respectivos están disponibles a través de una hoja de Excel hipervinculada de una sola pieza fácil de usar (consulte Disponibilidad de datos). A diferencia de estudios anteriores, nuestro trabajo basado en RNA-seq se complementa con ensayos de viabilidad realizados a través de la plataforma de alimentación de membrana artificial, la microinyección de hemocoel y también mediante la identificación de metabolitos por espectrometría de masas. Finalmente, hemos identificado el viroma de ARN específico de D. gallinae y hemos resaltado los virus de posible preocupación. Este trabajo presenta una evaluación integradora de datos recopilados y seleccionados que se originaron en Illumina, que describe los rasgos moleculares inherentemente vinculados al estilo de vida de D. gallinae que se alimenta de sangre, y revela su papel emergente como reservorio de nuevas variantes virales.

Los ácaros se recolectaron cepillando jaulas de gallinas productoras de huevos en International Poultry Testing Ustrasice (MTD Ustrasice, República Checa). Los ácaros se anestesiaron brevemente con CO2 usando un FlyPad (Flystuff.com) y se separaron en tres etapas de desarrollo: protoninfas, deutoninfas y adultos. Las protoninfas se separaron aún más en ácaros no alimentados y alimentados con sangre. Midguts fueron micro-diseccionados de las etapas adultas. Los ácaros se colocaron en una cinta adhesiva doble, con el lado ventral hacia abajo, se decapitaron con una navaja y se extrajeron los intestinos medios en una gota de solución salina tamponada con fosfato (PBS) tratada con dietilpirocarbonato (DEPC). Se homogeneizaron ácaros completos de diferentes etapas de desarrollo (n = 30 cada uno) con un mortero eppi, y se homogeneizaron intestinos medios (n = 40) usando una aguja de jeringa de insulina de 29 G. El ARN total se extrajo de los homogeneizados con un kit de ARN NucleoSpin (Macherey Nagel) y se eluyó en agua libre de ARNasa, con un rendimiento de 2 a 7 µg de ARN total. Un Agilent 2100 BioAnalyser evaluó la calidad del ARN, con valores RIN ≥ 9. Se preparó una biblioteca de ADNc sin cadena con el NEBNext® Ultra™ RNA Library Prep Kit for Illumina® y se secuenció en NovaSeq600 por Novagene Co., Ltd. como 150 pb lecturas de extremos emparejados.

El ensamblaje del transcriptoma y la extracción de la secuencia codificante se llevaron a cabo como se describió anteriormente92. Brevemente, las lecturas se despojaron de sus cebadores contaminantes y las bases con valores iguales < 20 se recortaron utilizando el programa Trim Galore (Krueger F. Trim Galore: a wrapper tool around Cutadapt and FastQC. Trim Galore. 2012). Las lecturas limpias se ensamblaron utilizando los ensambladores Abyss93 y Trinity94. Estos ensamblajes se fusionaron mediante una canalización paralela de ensamblador blastn y cap395 como se describió anteriormente96. Extrajimos todos los marcos de lectura abiertos de más de 200 nucleótidos, y se conservaron aquellos que coincidían con proteínas conocidas o que tenían un péptido señal. El péptido resultante y las secuencias de codificación se mapearon en una hoja de cálculo con hipervínculos, incluidas las coincidencias de blastp y rpsblast con varias bases de datos, así como una indicación del péptido señal97, los dominios transmembrana98 y los sitios de O-galactosilación99. Las transcripciones asignadas a una etapa de desarrollo dada se filtraron por un factor de cambio de 16 veces, es decir, para indicar una transcripción "específica de adulto", sus valores de FPKM fueron >16 veces superiores a sus valores de FPKM en el transcriptoma de FP, y al mismo tiempo , en el transcriptoma de deutoninfas alimentadas (ver "Disponibilidad de datos"). Para enumerar las transcripciones enriquecidas en el transcriptoma de feed over UP, solo se consideraron las transcripciones con anotaciones claras (valor E 10% y FPKM en FP> 5. Las transcripciones luego se enumeraron de acuerdo con las proporciones más altas de alimentos/no alimentos.

Preparamos muestras de ARN total, como se indicó anteriormente, en 3 a 5 réplicas biológicas independientes. Treinta ácaros (cuerpos enteros) o el intestino medio de cuarenta ácaros adultos se utilizaron para las extracciones de ARN, lo que produjo alrededor de 1 μg de ARN por extracción, con la excepción de las muestras de adultos (cuerpos enteros), que arrojaron alrededor de 8 μg de ARN por extracción. El cDNA monocatenario se transcribió inversamente a partir de 0,2 µg de RNA total utilizando el First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche) con cebadores oligo(dT)18. Para RT-qPCR, el ADNc se diluyó 10 veces en agua libre de nucleasas, con 10 pmol de cada cebador, y se procesó en 10 μL de reacción en placas de 384 pocillos (Placa de reacción de 384 pocillos MicroAmp™ Optical, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) , utilizando FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche Life Sciences), en el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio™ 6 Flex (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en las tablas complementarias S3, S4 y S7.

El conjunto de datos utilizado para los análisis filogenéticos de vitelogeninas de artrópodos constaba de 67 secuencias de aminoácidos que representaban homólogos de garrapatas, ácaros, ácaros, arañas, escorpiones, cangrejos herradura, insectos y crustáceos, siendo este último un grupo externo (Tabla complementaria S8). Las secuencias de vitelogenina se recuperaron como entradas anotadas en GenBank o se extrajeron de los ensamblajes de genoma/transcriptoma disponibles en GenBank utilizando el algoritmo tBlastN y un límite de valor E < 10−5. Las hemolipoglucoproteínas estructuralmente similares de garrapatas (p. ej., GenBank: ABK40086 y ACF35055) y sus secuencias de garrapatas relacionadas anotadas en GenBank como vitelogeninas (p. ej., GenBank: AXP34688, BAJ21514, AXP34687, XP_029826448) no se incluyeron en el análisis porque estas las proteínas no son verdaderos homólogos de vitelogenina. Las secuencias de vitelogenina se alinearon en MAFFT (v 7.017)100 implementado en Geneious Prime v2019.0.4101 mediante una selección automática de la estrategia de alineación y los parámetros predeterminados para la penalización por apertura de espacios (1,53) y el valor de compensación (0,123). Recortamos las regiones no homólogas de la alineación, utilizando GBlocks v0.91b102 con los parámetros predeterminados, excepto con una longitud de bloque mínima establecida en 5 y con la mitad de las posiciones abiertas permitidas, por lo que la alineación final comprendía 3578 posiciones de aminoácidos que comprenden los tres dominios estructurales típicos de vitelogeninas (es decir, la región N-terminal de vitelogenina, el dominio de función desconocida [DUF1943] y el dominio tipo D del factor von Willebrand). El árbol filogenético fue reconstruido por el método de máxima verosimilitud (ML) en IQ-TREE v1.6.12103 utilizando el modelo de proteína LG + F + R6 seleccionado por ModelFinder104. Bootstraps se basaron en 1000 repeticiones. El análisis de inferencia bayesiana (BI) se realizó en MrBayes v3.2.7a105 implementado en CIPRES Science Gateway v3.3106 utilizando cuatro cadenas MCMC simultáneas muestreadas a intervalos de 100 árboles y probabilidades posteriores estimadas a partir de 2 millones de generaciones. El modelo de evolución WAG + F + G4 fue seleccionado por ModelFinder. El período de quemado representó el 10% de todas las generaciones. El árbol se visualizó en Geneious Prime v2019.0.4 y se modificó gráficamente en Adobe Illustrator CS5.

Para el análisis filogenético de la familia de genes de canales iónicos dependientes del ligando cys-loop, utilizamos un conjunto de datos que constaba de 121 secuencias de aminoácidos que correspondían al conjunto de datos de Dermauw et al.40 y se enriquecieron para los homólogos de D. gallinae (Suplementario Datos S1). Las secuencias recuperadas de las entradas anotadas de GenBank se alinearon y trataron como se describe anteriormente para el conjunto de datos de vitelogenina. El alineamiento final comprendía 502 posiciones de aminoácidos. El árbol filogenético basado en ML y sus soportes nodales se calcularon utilizando el modelo de proteína LG + I + G4 como se describe para las vitelogeninas.

Para el análisis filogenético de la familia de proteínas que contienen tioéster (TEP), el conjunto de datos contenía 29 secuencias de aminoácidos de TEP de D. gallinae y sus homólogos de invertebrados de la mosca de la fruta D. melanogaster, la garrapata dura I. ricinus y el cangrejo herradura. L. polyphemus (Fig. S8 complementaria). Las secuencias se alinearon y trataron como se describe anteriormente para el conjunto de datos de vitelogenina. La alineación final de las secuencias de aminoácidos completas (~1500 residuos) comprendía 2737 posiciones de aminoácidos. El árbol filogenético basado en ML y sus soportes nodales se calcularon utilizando el modelo de proteína BLOSUM62 + G como se describe para las vitelogeninas.

Para el análisis metabolómico, los ácaros recolectados en un gallinero por cepillado se almacenaron en una botella de 1 L con tapa de papel a 21 °C en la oscuridad. Al día siguiente, se clasificó una mezcla de huevos, larvas y UP como se describe anteriormente. Luego, la muestra de estadios no alimentados (para evitar la detección de intermediarios del hemo de origen del huésped), con una fracción predominante de UP de 21,4 mg de ácaros, se extrajo con 150 µL de un medio de extracción en frío, MeOH:ACN:H2O (2:2: 1 v/v/v), que contiene un estándar interno, 4-fluorofenilalanina (100 µL de 0,5 ng/µL). A continuación, la muestra se homogeneizó utilizando un Tissue Lyser II (Qiagen, Praga, República Checa) a 50 Hz, 0 °C durante 5 min. Luego, la mezcla se centrifugó a 7000 RPM y 5 °C durante 10 min, y el sobrenadante se filtró a través de un filtro mini-spin de PVDF de 0,2 μm (HPST, Praga, República Checa) a 8000 RPM y 5 °C durante 10 min. Finalmente, se usó una alícuota de 50 µL del sobrenadante para el análisis espectrométrico de masas de alta resolución y cromatografía líquida (LC-HRMS). Los métodos LC-HRMS se describieron en detalle anteriormente107,108. Brevemente: se utilizó un espectrómetro de masas AQ Exactive Plus Orbitrap acoplado con un cromatógrafo de líquidos Dionex Ultimate 3000 (todo Thermo Fisher Scientific, San José, CA, EE. UU.) para perfilar los intermedios de la biosíntesis del hemo. Los metabolitos se separaron en un SeQuant ZIC-pHILIC de 150 mm × 4,6 mm de d.i., 5 μm (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) con un caudal de fase móvil de 450 μL/min, un volumen de inyección de 5 μL y una temperatura de columna de 35 °C. La fase móvil fue: A = acetonitrilo, B = 20 mmol/L de carbonato de amonio acuoso (pH = 9,2; ajustado con NH4OH); gradiente: 0 min, 20% B; 20 min, 80% B; 20,1 min, 95% B; 23,3 min, 95% B; 23,4 minutos, 20% B; 30,0 min 20% B. Los ajustes de Q-Exactive fueron: Rango de masas 70–1000 Daltons; Resolución de 70 000 (m/z 200; objetivo de control automático de ganancia (AGC) 3 × 106 y tiempo máximo de inyección de iones (IT) 100 ms; electrospray operado en modo positivo: voltaje de spray de 3000 kV, temperatura capilar de 350 °C, gas envolvente a 60 au, gas auxiliar a 20 au, gas de repuesto a 1 au, temperatura de la sonda a 350 °C y nivel de lente S a 60 au Los datos se procesaron con el software XcaliburTM, versión 4.0 (Thermo Fisher Scientific, San José, CA, EE. UU.). Compuestos utilizados en el estudio: El agua desionizada se preparó utilizando un sistema de purificación Direct Q 3UV (Merck, Praga, República Checa), el metanol y el acetonitrilo (grado OptimaTM) se compraron a Fisher Scientific (Pardubice, República Checa), el carbonato de amonio al 25 %. solución de amoníaco, 4-fluorofenilalanina, 5-aminolevulinato, hemina, porfobilinógeno y protoporfirina IX de Merck (Praga, República Checa) La cantidad de hemo b se estimó en base al área del pico del patrón.

Los ácaros se recogieron y almacenaron como se ha descrito anteriormente. Después de 14 días, los individuos vitales fueron seleccionados y utilizados para experimentos de alimentación ex vivo. La unidad de alimentación era un cilindro de plástico (17 mm de diámetro, 70 mm de longitud) dividido horizontalmente en dos cámaras iguales por una membrana (piel de Goldbeater impregnada de silicona). La cámara superior contenía 2 ml de sangre de pollo fresca, desfibrinada (mediante mezcla con perlas de vidrio de 4 mm) complementada con el inhibidor Torin2 (Sigma-Aldrich, número de catálogo SML1224). La cámara inferior del dispositivo de alimentación de membrana contenía los ácaros. La unidad de alimentación se colocó en la oscuridad en una incubadora a 41 °C. Después de 5 h, los individuos alimentados se recolectaron y almacenaron en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (10 individuos en cada uno) en una incubadora a 21 °C. Se controló la viabilidad y vitalidad de los ácaros cada 24 h durante 7 días. Torin2 se disolvió en DMSO y luego se diluyó hasta las concentraciones finales: 500, 250, 100, 10 y 1 µM. Las reservas de DMSO se diluyeron en la harina de sangre a DMSO al 1% v/v en las harinas de sangre.

Se recogieron los ácaros como se ha descrito anteriormente y se clasificaron las hembras adultas recién alimentadas. Los ácaros se inmovilizaron en una cinta adhesiva y se microinyectó un volumen de 13,8 nL del compuesto probado (≤1% v/v DMSO) en el hemocoel del ácaro (Drummond, EE. UU.). Después de 10 min, los ácaros inyectados se recolectaron en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (5 individuos en tubos de 5 eppi u 8 individuos en tubos de 3 eppi para cada concentración) y se almacenaron en la incubadora a 21 °C. Se controló la viabilidad y vitalidad de los ácaros cada 24 h durante 7 días. Compuestos utilizados en el estudio: Fipronil (Sigma-Aldrich Supelco, número de catálogo 16785), Fluralaner (Cayman Chemical, número de artículo 22061), Ivermectina (Sigma-Aldrich, número de catálogo I8898).

El descubrimiento, la detección y la caracterización de virus se implementaron como se describe en otro lugar109. En resumen, utilizamos ensamblajes de transcriptomas generados en este trabajo como entrada para el descubrimiento de virus. La liberación completa de NR de secuencias de proteínas virales se obtuvo de https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=txid10239[Organism:exp]. El ensamblaje integrado de ARN del ácaro rojo se evaluó mediante múltiples búsquedas de tBlastN (valor E máximo = 1 × 10−5) usando, como sonda, las proteínas virales no redundantes predichas completas en un servidor local. Las homologías significativas se examinaron manualmente y se descartaron los contigs redundantes. Las secuencias similares a virus potenciales se seleccionaron mediante mapeo iterativo de lecturas utilizando Bowtie 2 v2.4.4110. Los marcos abiertos de lectura (ORF) fueron predichos por ORFfinder. Las proteínas pronosticadas se sometieron a búsquedas BlastP en NCBI y a búsquedas Blast basadas en dominios contra la base de datos de dominios conservados (CDD) v3.19 implementada en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml y complementado con SMART http://smart.embl-heidelberg.de/, Pfam http://pfam.xfam.org/, PROSITE http://prosite.expasy.org/ y HHPred https://toolkit.tuebingen. mpg.de/tools/hhpred para caracterizar dominios funcionales más divergentes. Los péptidos señal y de membrana se evaluaron con SignalP v4.1111. Los niveles de ARN viral se calcularon con Cufflinks http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/ o alternativamente con Geneious suite 8.1.9 (Biomatters Inc.) como fragmentos por kilobase de transcripción de virus por millón de lecturas mapeadas (FPKM ). Los conocimientos evolutivos se resolvieron mediante MAFTT (v 7.310)100 alineaciones de secuencias de aminoácidos de las polimerasas virales predichas o proteínas de la cápside, que se usaron para análisis filogenéticos basados ​​en árboles filogenéticos de probabilidad máxima aproximada de FastTree http://www.microbesonline.org/ fasttree/ con parámetros estándar. El soporte para nodos individuales se evaluó mediante una prueba de razón de verosimilitud aproximada con el procedimiento similar a Shimodaira-Hasegawa. La topología del árbol, los valores de soporte y las sustituciones por sitio se basaron en 1000 remuestreos de árboles. La mayoría de los resultados del análisis de secuencias se integraron y visualizaron utilizando la suite Geneious 8.1.9 (Biomatters Inc.). Los diagramas del genoma del virus se diseñaron utilizando Adobe Photoshop C3 versión 10.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos están disponibles como BioProject PRJNA597301, incluidos los archivos nt y aa fasta, y una hoja de Excel con hipervínculo está disponible para descargar en https://proj-bip-prod-publicread.s3.amazonaws.com/transcriptome/Dermanyssus_gallinae/Derm_gallinae.zip . Las secuencias virales se depositaron en el NCBI con los siguientes números de acceso de GenBank:

RMACTV1-L,ON160022;RMACTV1-S,ON160023;RMQV1-HA,ON160024;RMQV1-NP,ON160025; RMQV1-PA,ON160026;RMQV1-PB1,ON160027;RMQV1-PB2,ON160028;RMDIV1,ON160029; RMIV1, ON160030;RMDEV1,ON160031;RMVLV1,ON160032;RMVLV2,ON160033;RMACYV1,ON160034;RMAHV1,ON160035.

Los datos sin procesar utilizados para generar la Fig. 4b se depositaron en el repositorio de Figshare con los siguientes DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22658317.v1, https://doi.org/10.6084/m9.figshare .22658338.v1, https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22658386.v1, https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22658458.v1.

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Este trabajo fue apoyado principalmente por el programa ZETA de la Agencia de Tecnología de la República Checa subvención no: TJ02000107 a JP, y además por la subvención de la Fundación de Ciencias Checa Nos. 22-18424M a JP, 20-05736S y 21-08826S a PK, y por el "Centro de Investigación de la patogenicidad y virulencia de los parásitos" (Nº CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759) financiado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) y Ministerio de Educación, Juventud y Deporte (MEYS). JMCR recibió el apoyo del Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (Enfermedades transmitidas por vectores: Biología de la relación entre vectores y huéspedes, Z01 AI000810-20). Este trabajo utilizó los recursos computacionales del grupo NIH HPC Biowulf (http://hpc.nih.gov). Agradecemos a la Dra. Martina Hajduskova (www.biographix.cz) por la visualización gráfica. También estamos agradecidos por la crítica constructiva de los revisores de manuscritos.

Estos autores contribuyeron por igual: José M. Ribeiro, David Hartmann.

Laboratorio de Investigación de Vectores y Malaria, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Bethesda, MD, EE. UU.

José M. Ribeiro

Instituto de Parasitología, Centro de Biología, Academia Checa de Ciencias, 37005, České Budějovice, República Checa

David Hartmann, Pavla Bartošová-Sojková, Martin Palus, Matěj Kučera, Ondřej Hajdušek, Daniel Sojka, Petr Kopáček y Jan Perner

Instituto de Patología Vegetal, Centro de Investigaciones Agropecuarias, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (IPAVE-CIAP-INTA), Córdoba, Argentina

Humberto Debate

Instituto de Entomología, Centro de Biología, Academia Checa de Ciencias, 37005, České Budějovice, República Checa

Martin Moos y Petr Simek

Estación internacional de análisis de aves de corral Ústrašice, Ústrašice, República Checa

Jiří Fara

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Correspondencia a Jan Perner.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Ben Mans, Han Xia y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: Luke R. Grinham.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Ribeiro, JM, Hartmann, D, Bartosová-Sojková, P et al. Adaptaciones de alimentación de sangre y evaluación de viroma del ácaro rojo de las aves de corral Dermanyssus gallinae guiado por RNA-seq. Comun Biol 6, 517 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04907-x

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Recibido: 20 mayo 2022

Aceptado: 03 mayo 2023

Publicado: 13 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04907-x

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