Caracterización molecular y eficacia inmunológica de la fructosa

Parásitos y vectores volumen 16, Número de artículo: 169 (2023) Citar este artículo

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Las garrapatas son ectoparásitos hematófagos obligados que transmiten una variedad de patógenos a los humanos, la vida silvestre y los animales domésticos. La vacunación es un método eficaz y respetuoso con el medio ambiente para el control de las garrapatas. La fructosa-1,6-bisfosfato aldolasa (FBA) es una importante enzima del glucometabolismo que es una vacuna candidata contra los parásitos. Sin embargo, la protección inmunológica de FBA en garrapatas no está clara.

El marco de lectura abierto (ORF) de 1092 pb de FBA de Haemaphysalis longicornis (HlFBA), que codifica una proteína de 363 aminoácidos, se clonó utilizando la metodología de PCR. El vector de expresión procariótico pET32a(+)-HlFBA se construyó y transformó en células de la cepa BL21(DE3) de Escherichia coli para la expresión de proteínas. La proteína HlFBA recombinante (rHlFBA) se purificó mediante cromatografía de afinidad, y los resultados de transferencia Western sugirieron que la proteína rHlFBA era inmunogénica.

Los resultados del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas mostraron que los conejos inmunizados con rHlFBA produjeron una respuesta inmune humoral específica para rHlFBA. Un ensayo de infestación de garrapatas indicó que, en comparación con las garrapatas del grupo de tiorredoxina marcada con histidina (Trx), el peso de la garrapata congestionada y la oviposición de las garrapatas hembra y la tasa de eclosión de los huevos del grupo de rHlFBA se redujeron en un 22,6%, 45,6% y 24,1%, respectivamente. Basándose en el efecto acumulativo de estos tres parámetros, se estimó que la eficacia inmunitaria global de rHlFBA era del 68,4 %.

FBA es una vacuna candidata contra las garrapatas que puede reducir significativamente el peso de las garrapatas, la oviposición y la tasa de eclosión de los huevos. El uso de enzimas implicadas en el metabolismo de la glucosa es una nueva estrategia en el desarrollo de vacunas antigarrapatas.

Las garrapatas, que son artrópodos que se alimentan de sangre obligatoriamente, son los principales vectores de patógenos en humanos y animales en todo el mundo [1]. Tanto las garrapatas como los microbios que transmiten son amenazas importantes para la salud humana y veterinaria [2]. Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae) es una especie de garrapata nativa del este de Asia y se ha establecido en Australia, Nueva Zelanda y varias islas del Pacífico [3]. Transmite patógenos como Theileria uilenbergi, Babesia motasi, Rickettsia hebeiii y Anaplasma phagocytophilum [4,5,6,7]. También es el vector de la fiebre severa con el virus del síndrome de trombocitopenia (SFTSV), que pone en peligro la salud humana y animal [8]. Por lo tanto, es imperativo desarrollar un anti-H. longicornis vacuna [9, 10].

Galay et al. evaluaron dos tipos de ferritinas de proteínas de unión al hierro de H. longicornis (HlFER), una HlFER1 intracelular y una HlFER2 secretora, como vacunas contra las garrapatas [11]. Los resultados de la transferencia Western demostraron que los anticuerpos reaccionaron de forma cruzada con el HlFER recombinante (rHlFER) y también reaccionaron con los HlFER nativos. Un experimento de desafío con garrapatas demostró que las garrapatas alimentadas con el conejo inoculado con rHlFER2 tenían un peso de ingurgitación más bajo que las garrapatas del grupo de control. La oviposición y la incubabilidad se redujeron en ambos grupos inoculados con rHlFER. La eficacia de la vacuna de rHlFER1 y rHlFER2 fue del 34% y 49%, respectivamente [11]. En otro estudio, se identificó el marco de lectura abierto (ORF) de la subolesina de H. longicornis (HlSu) y se expresó la HlSu recombinante (rHlSu) en Escherichia coli [12]. Los conejos inmunizados con rHlSu produjeron una respuesta inmune. En el grupo inmunizado con rHlSu, el peso de la ingurgitación y la oviposición de las garrapatas hembra fueron significativamente menores que en el grupo de control. La eficacia calculada de la vacuna se estimó en un 37,4 % [12]. En un estudio posterior, Wang et al. clonado el gen del homólogo de lipocalina de H. longicornis (HlLIP) en pET-32(a+) para obtener la proteína recombinante (rHlLIP); la inmunogenicidad de RHlLIP fue confirmada por western blot [13]. Un ensayo de inmunización en conejos infestados con H. longicornis mostró que los anticuerpos contra la proteína rHlLIP redujeron el peso de la ingurgitación, la oviposición y la incubabilidad (la eficacia de la vacuna de la proteína rHlLIP fue del 60,17 %). Sin embargo, hasta la fecha, un anti-H comercial. longicornis vacuna no está disponible actualmente, por lo que es importante buscar un antígeno protector eficaz contra la infestación por H. longicornis.

La fructosa-1,6-bisfosfato aldolasa (FBA) es una enzima que cataliza la fructosa-1,6-bisfosfato a gliceraldehído-3-fosfato y dihidroxiacetona fosfato o la reacción de condensación inversa del alcohol aldólico [14]. La FBA, que puede inducir respuestas inmunitarias en muchas enfermedades infecciosas [15], también puede utilizarse como vacuna de amplio espectro contra muchos patógenos [16,17,18,19,20]. En un estudio, los ratones inoculados con FBA recombinante (rFBA) + adyuvante de Freund adquirieron protección inmune contra el desafío de Streptococcus pneumoniae [21]. En comparación con el adyuvante de Freund solo, el adyuvante de rFBA + Freund aumentó la proliferación de células T CD4+ de memoria en ratones y aumentó significativamente las tasas de supervivencia. Los sueros anti-rFBA de ratones también protegieron significativamente a los ratones contra un desafío letal de S. pneumoniae en comparación con los sueros preinmunes [21]. Estos datos sugieren que rFBA es una vacuna candidata para la protección contra S. pneumoniae. McCarthy et al. verificó que Onchocerca volvulus FBA (OvFBA) es inmunogénico. Cuando se probó la eficacia protectora de OvFBA recombinante en ratones, la supervivencia de las larvas se redujo en un 50 % [16]. Estos datos respaldan el estudio adicional de esta enzima como vacuna candidata en modelos animales.

En el presente estudio, clonamos el ORF de FBA de H. longicornis (HlFBA) y usamos E. coli para expresar la proteína HlFBA recombinante (rHlFBA). Luego analizamos su eficacia de protección inmunológica inmunizando conejos. Los resultados indican que H1FBA podría ser una vacuna útil contra la infección por H. longicornis.

Se recolectaron garrapatas adultas de H. longicornis de ovejas del Área de Reserva Natural Nacional Xiaowutai de la provincia de Hebei en mayo y se enviaron al laboratorio como se describió anteriormente [22]. Durante la fase no parasitaria, las garrapatas se mantuvieron en una incubadora; durante la fase parasitaria, las garrapatas se alimentaron de las orejas de conejos blancos de Nueva Zelanda. La próxima generación de garrapatas adultas se recolectó en diferentes etapas de desarrollo para los experimentos. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Normal de Hebei (#2021LLSC035).

El ARN total de hembras adultas de H. longicornis se extrajo utilizando el reactivo TRIzol (TransGen, Beijing, China) para una mayor síntesis de ADN complementario (ADNc) como se describió anteriormente [23]. El ORF del gen H1FBA (HlFBA) se amplificó y clonó utilizando los cebadores 5′-ATGGCTGGCCACTTCAC-3′ y 5′-TCAGTACTCGTGGTTTTTGATA-3′. HlFBA se obtuvo mediante ciclos de PCR que constaban de los siguientes pasos: predegeneración a 94 °C durante 3 min; 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 30 s, recocido a 60 °C por 30 s y extensión a 72 °C por 60 s; una extensión final a 72 °C por 10 min. Los productos de PCR obtenidos se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, seguido de la recuperación y ligadura de las bandas diana en un vector pEASY-T1, que posteriormente se transformó en células TRANS-T1 (TransGen) para su secuenciación. La secuencia génica correcta se tradujo a la secuencia de aminoácidos seguida de una alineación de secuencias múltiples utilizando DNAMAN 8.0 (Lynnon Biosoft, Quebec, ONT, Canadá).

Los perfiles de transcripción de HlFBA de diferentes etapas de desarrollo (huevo, larva, ninfa y adulto) y diferentes órganos (glándulas salivales, intestino medio, ovario y túbulos de Malpighi) de garrapatas hembra se estimaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Se diseñaron cebadores específicos de HlFBA (cebador directo: 5'-TCTGACCAAGAGGTGCGT-3'; cebador inverso: 5'-GTAGCGAGCGAGGAC-ATT-3'). La expresión relativa del gen de la β-actina de H. longicornis (AN AY254898) se utilizó para normalizar los datos de expresión de HlFBA [24]. Los datos de expresión génica se calcularon mediante el método 2−ΔΔCt [25]. Todos los análisis se realizaron utilizando tres réplicas técnicas y tres biológicas.

Los cebadores que contenían sitios de restricción EcoRI y HindIII (cebador directo: 5'-GAATTCATGGCTGGCCACTTCAC-3'; cebador inverso: 5'-AAGCTTTCAG-TACTCGTGGTTTTTGATA-3') se usaron para amplificar HlFBA por PCR. Los productos de la PCR se separaron mediante electroforesis en agarosa y el gen diana se recuperó mediante un kit de recuperación de gel de ADN (BioTeke Corp., Beijing, China) y se insertó en el plásmido de expresión procariótico pET-32a(+) (TransGen), denominado pET- 32a(+)-HlFBA. Para la expresión de rHlFBA, los plásmidos se transformaron en células de E. coli cepa BL21 (DE3) (Takara Bio Inc., Shiga, Japón) y las células se propagaron en 10 ml de caldo Luria-Bertani (LB) que contenía 10 μg/ml de ampicilina ( TransGen) durante la noche a 37 °C y 200 rpm, después de lo cual se utilizaron para inocular cultivos de 100 ml. La proteína rHlFBA se indujo con isopropil-β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,5 mM a 25 °C, y los sobrenadantes de los cultivos celulares se purificaron por elución a lo largo de un gradiente de imidazol (20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM y 500 mM) en Ni. Resina de cromatografía de flujo rápido Sepharose 6 (GE Healthcare, Chicago, IL, EE. UU.). La proteína rHlFBA se cuantificó utilizando el método de Bradford [26]. La proteína tiorredoxina (Trx) etiquetada con histidina expresada por el plásmido pET-32(a+) se purificó utilizando el procedimiento anterior.

Diez garrapatas hembra sin alimentar se molieron en nitrógeno líquido y se transfirieron a un tubo que contenía 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,1 M. Después de la centrifugación a 13.000 rpm durante 10 min a 4 °C, se inyectaron en un conejo 500 μg de proteína de garrapata, mezclada con adyuvante completo de Freund. A esto le siguieron dos inyecciones de 500 µg de proteína de garrapata mezclada con adyuvante incompleto de Freund a intervalos de 2 semanas. Los sueros se recogieron el día 14 después de la última inmunización y se purificaron mediante el método de precipitación con ácido caprílico-sulfato de amonio para obtener anticuerpos anti-H de conejo. suero longicornis.

Una muestra de 20 μg de proteína total, incluido el marcador de proteína preteñido (TransGen), rHlFBA purificada y E. coli inducida por IPTG que contenía pET-32a(+)-HlFBA, se cargó en electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 12 % (SDS -PAGE), teñidos con Coomassie Brilliant Blue y transferidos a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Después de bloquear en TBS-Tween-20 (TBST) que contenía leche descremada al 5 % a 25 °C durante 3 h, la membrana se incubó con anti-H de conejo diluido 1:2000. longicornis o suero negativo de conejo durante la noche, respectivamente. A continuación, las membranas se lavaron con TBST y se incubaron con inmunoglobulina G anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) diluida 1:2000 (IgG; Proteintech, Chicago, IL, EE. UU.) durante 2 h. Las señales positivas se detectaron utilizando SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y se fotografiaron a través de un sistema de imágenes de quimioluminiscencia (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.).

Los conejos se dividieron aleatoriamente en el grupo PBS, el grupo Trx y el grupo rHlFBA (6 conejos por grupo). En el grupo experimental, se inyectaron 0,5 ml de rHlFBA (1 μg/μl) mezclado con 0,5 ml de adyuvante completo de Freund en el lomo de conejos el día 0, y la misma dosis de rHlFBA mezclado con adyuvante incompleto de Freund se inyectó en el lomo de conejos en el día 14 y el día 28, respectivamente. En el grupo de control, se inyectaron 0,5 ml de proteína PBS o Trx (1 μg/μl) mezclada con adyuvante usando el mismo protocolo en la espalda de los conejos.

Antes de la primera inmunización y los días 7, 14, 21, 28 y 35 después de la primera inmunización, se recogió sangre de las orejas de los conejos para el análisis del nivel de anticuerpos y la determinación de los valores de densidad óptica (DO); las mediciones se realizaron a la misma dilución, reflejando el nivel de anticuerpos [27]. Las proteínas rHlFBA (1 μg/pocillo) se usaron para recubrir placas de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) durante la noche a 4 °C, después de lo cual las placas se bloquearon con albúmina de suero bovino a 37 °C durante 1 h. A continuación, las placas se incubaron con el suero de conejo inmunizado a 37 °C durante 1 h, que se había diluido en serie de 1:200 a 1:204.800, y luego con IgG de cabra anti-conejo conjugada con HRP (1:10.000) durante 1 h a 37 °C, respectivamente. Finalmente, se añadió a las placas 3,3',5,5'-tetrametilbencidina como solución de sustrato de color y la reacción se terminó con la adición de una solución de ácido sulfúrico. La absorbancia a OD450 se midió utilizando un lector de microplacas (Molecular Devices, Silicon Valley, CA, EE. UU.).

El décimo día después de la tercera inmunización de conejos (3 grupos, 6 conejos por grupo), se liberaron 46 garrapatas adultas (23 hembras y 23 machos) en bolsas de tela pegadas a una oreja del conejo. El mismo tratamiento se realizó en la otra oreja del conejo. Luego, después del desprendimiento de las garrapatas hembra de los hospedadores, se registró el número de garrapatas mordedoras, el peso de la garrapata congestionada, la oviposición y las tasas de eclosión de los huevos. La eficacia de la vacuna (E) se calculó como 100 × [1–(EW × EO × EH)], donde EW, EO y EH representan el peso de la garrapata congestionada, la oviposición y las tasas de eclosión de huevos de los grupos experimentales/grupo de control, respectivamente [11 ].

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS versión 17.0 (IBM Corp., Armonk, NY, EE. UU.). Se verificó la normalidad de todos los datos presentados en figuras y tablas. Los niveles de anticuerpos en la sangre recolectada de los diferentes grupos en el mismo punto de tiempo se analizaron mediante ELISA para determinar las diferencias entre el grupo experimental y el grupo de control mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA). La expresión de HlFBA en el análisis qRT-PCR y los diferentes parámetros (peso de la ingurgitación, oviposición y incubabilidad) en el ensayo de infestación por garrapatas se analizaron mediante ANOVA de una vía seguido de la prueba de Tukey, para determinar las diferencias entre los diferentes tratamientos. El nivel de significación se fijó en P < 0,05.

La longitud del ORF de HlFBA en H. longicornis fue de 1092 pb (KX839690.1) y codificó 363 aminoácidos (aa). Los resultados de alineación múltiple indicaron que la proteína HlFBA (ASV64058.1) compartía una similitud del 95 %, 91 %, 90 % y 89 % con FBA de Dermacentor silvarum (XP_037566647.1), Ixodes scapularis (XP_029847818.1), Amblyomma variegatum (DAA34561. 1) y Rhipicephalus microplus (XP_037283106.1), respectivamente. La proteína HlFBA tenía entre un 77 % y un 81 % de aminoácidos conservados en comparación con las FBA de otros arácnidos, como Araneus ventricosus (GBN85837.1), Parasteatoda tepidariorum (XP_042900530.1), Varroa destructor (XP_022668058.1), Trichonephila clavipes (GFY24485 .1) y Tropilaelaps mercedesae (OQR70008.1) (Fig. 1).

Alineación de las secuencias de aminoácidos predichas de la proteína fructosa-1,6-bifosfato aldolasa de Haemaphysalis longicornis y otras especies de Arachnida. Números de acceso de GenBank: H. longicornis (ASV64058.1), Dermacentor silvarum (XP_037566647.1), Ixodes scapularis (XP_029847818.1), Amblyomma variegatum (DAA34561.1), Rhipicephalusmicroplus (XP_037283106.1), Trichonephila clavip es (GFY24485.1 ), Parasteatoda tepidariorum (XP_042900530.1), Araneus ventricosus (GBN85837.1), Varroa destructor (XP_022668058.1) y Tropilaelaps mercedesae (OQR70008.1)

Los resultados de qRT-PCR mostraron que HlFBA se expresó en diferentes etapas de desarrollo y que su expresión en garrapatas adultas fue significativamente mayor que en otras etapas de desarrollo (F = 7.196; df = 3, 8; P < 0.01; Fig. 2a). Además, se encontró HlFBA en todos los tejidos detectados de garrapatas hembra, y el ovario mostró el nivel de expresión más alto (F = 218.197; df = 3, 8; P < 0.01; Fig. 2b).

Patrones de expresión de HlFBA en diferentes etapas de desarrollo (a) y diferentes órganos (b). Las letras minúsculas diferentes sobre las barras representan diferencias significativas en el grupo (P < 0,05). Los círculos representan puntos individuales de cada grupo. Todos los análisis se realizaron utilizando tres réplicas técnicas y tres biológicas. HlFBA, gen de fructosa-1,6-bifosfato aldolasa de Haemaphysalis longicornis

El peso molecular de la proteína rHlFBA fue de aproximadamente 62 kDa, según lo determinado por SDS-PAGE, representando Trx del plásmido vacío 22 kDa (Fig. 3a). La proteína rHlFBA se expresó en gran medida en el sobrenadante inducido durante 6 ha 25 °C y se purificó bien en condiciones de elución con imidazol 200 mM (Fig. 3b). Los resultados de la transferencia Western mostraron que solo la proteína rHlFBA reaccionó positivamente con anticuerpos anti-H de conejo. longicornis suero, lo que indica su especificidad inmunogénica (Fig. 3c).

Electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y análisis de transferencia Western de rHlFBA. una SDS-PAGE de la expresión de la proteína rHlFBA en células de la cepa BL21 de Escherichia coli inducida por isopropil-β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,5 mM a 25 °C. Carriles: 1 Producción de la proteína rHlFBA sin IPTG; 2, 3, 4, 5 producción de proteína rHlFBA en el sobrenadante con IPTG a 25 °C durante 2, 4, 6 y 8 h, respectivamente; marcador M; 6, 7, 8, 9 producción de la proteína rHlFBA en la precipitación con IPTG a 25 °C durante 2, 4, 6 y 8 h, respectivamente. b Análisis SDS-PAGE de elución de proteína rHlFBA. Carriles: Marcador M; 1 producción de la proteína rHlFBA con inducción de IPTG; 2–6 proteína rHlFBA eluida con imidazol 20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM y 500 mM, respectivamente. c Análisis de transferencia Western de la proteína rHlFBA. Carriles: Marcador M; 1 rHlFBA purificado por columna de Ni incubado con conejo anti-H. suero longicornis; 2 E. coli inducida por IPTG con pET-32a(+)-HlFBA incubada con anti-H. suero longicornis; 3 rHlFBA purificado por columna de Ni incubado con suero negativo de conejo. Las flechas indican la proteína rHIFBA. rH1FBA, fructosa-1,6-bifosfato aldolasa recombinante de Haemaphysalis longicornis

Los resultados de ELISA mostraron que el nivel de anticuerpos de los conejos inmunizados con rHlFBA aumentó gradualmente al aumentar el tiempo de inmunización. El nivel de anticuerpos comenzó a aumentar significativamente el séptimo día después de la segunda inoculación (F = 677,175; df = 2, 3; P < 0,01) y mantuvo un nivel más alto hasta la tercera inoculación (Fig. 4). Sin embargo, los niveles de anticuerpos en el grupo Trx y el grupo PBS no cambiaron significativamente (F = 677,175; df = 2, 3; P = 0,081).

Detección del nivel de anticuerpos anti-rHlFBA (fructosa-1,6-bifosfato aldolasa recombinante de Haemaphysalis longicornis) en suero de conejo mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. Las flechas indican los días de vacunación. Las letras minúsculas diferentes representan diferencias significativas en el grupo en el momento indicado (P < 0,05). Los círculos rojos, los cuadrados azules y los triángulos negros representan los valores de DO detectados por ELISA en el grupo HlFBA, el grupo Trx y el grupo PBS en diferentes momentos, respectivamente. Todos los análisis se realizaron utilizando tres réplicas técnicas y tres biológicas.

El décimo día después de la tercera inmunización, se expusieron conejos blancos de Nueva Zelanda a garrapatas adultas. Los diferentes parámetros del grupo PBS, grupo Trx y grupo rHlFBA se analizaron mediante ANOVA de una vía. Los resultados del ensayo de infestación por garrapatas sugirieron que el peso de la ingurgitación, la oviposición y la incubabilidad entre el grupo PBS y el grupo Trx no cambiaron significativamente con el tiempo (F = 5,258, P = 0,995; F = 9,331, P = 0,448; F = 80,895, P = 0.947, respectivamente; gl = 2, 15 para todos; Tabla 1). En comparación con el grupo Trx, la media (± error estándar) del peso de la garrapata congestionada (F = 5.258; df = 2, 15; P < 0.05), la oviposición (F = 9.331; df = 2, 15; P < 0.01) y el huevo -las tasas de eclosión (F = 80,895, df = 2, 15; P < 0,01) del grupo rHlFBA fueron 142,10 ± 25,09, 36,12 ± 13,68 y 59,65 ± 1,86 %, que representaron una reducción del 22,6 %, 45,6 % y 24,1 %, respectivamente. La eficacia inmunológica estimada, calculada según los parámetros anteriores, de la vacunación con rHlFBA fue del 68,4%.

La fructosa-1,6-bisfosfato aldolasa es una enzima clave en la glucólisis y la gluconeogénesis, y está estrechamente relacionada con las actividades vitales, la adquisición de energía y las actividades metabólicas de los organismos [14]. Varios estudios han demostrado que, además de su papel glucolítico normal, desempeña un papel en la invasión del huésped [28]. En el presente estudio, realizamos la caracterización molecular de HlFBA de H. longicornis y estimamos su eficacia para brindar protección inmunológica a los conejos.

Prompipack et al. amplificó el gen FBA de Opisthorchis viverrini por PCR y determinó que su secuencia completa era de 1089 pb y codificaba 362 aa [15]. Li et al. caracterizó la FBA de Clonorchis sinensis FBA, reportando tres ORF (CsFBA-1, CsFBA-2 y CsFBA-3) con longitudes de 1089, 1092 y 1092 pb, codificando 362 aa, 363 aa y 363 aa, respectivamente [29]. En el presente estudio, el tamaño de la proteína codificada por HlFBA de H. longicornis fue consistente con los informados para las especies de trematodos parásitos. El alineamiento de secuencias mostró que la identidad de la secuencia de aminoácidos entre HlFBA de H. longicornis y las de otras garrapatas era > 89 %, pero < 81 % con las de otras especies de Arachnida, lo cual es coherente con su relación evolutiva.

Yang et al. detectó la transcripción del ARN mensajero (ARNm) de Trichinella spiralis FBA (TsFBA) en todas las etapas de desarrollo de T. spiralis [30]. En el presente estudio, los resultados de qRT-PCR mostraron que la expresión de HlFBA se produjo en diferentes etapas de desarrollo de las garrapatas, siendo más alta en adultos. Esto puede estar relacionado con las diferencias en el tamaño individual y la actividad metabólica. Las garrapatas adultas son más grandes, con mayor actividad metabólica y necesidades energéticas, por lo que esta puede ser la razón por la que la expresión es mayor en esta etapa. La diferencia de expresión en diferentes tejidos es adecuada para la función fisiológica de cada tejido. La expresión más alta de HlFBA en el ovario puede estar relacionada con un metabolismo vigoroso y la actividad metabólica más alta en la etapa temprana de formación de óvulos. Sin embargo, el mecanismo específico necesita más estudio.

Dado que la FBA desempeña un papel central en las actividades y la supervivencia de los parásitos, se la ha considerado una vacuna candidata potencial o un objetivo quimioterapéutico para el tratamiento [30]. En el estudio de Yang et al., después de que los ratones fueron inmunizados con T. spiralis FBA recombinante (rTsFBA), los resultados de ELISA mostraron un aumento significativo en los niveles de IgG en el grupo rTsFBA en comparación con el grupo de control. Esto resultó en una respuesta inmune humoral y celular mixta T helper 1/T helper 2 (Th1/Th2), con células Th2 predominantes, así como niveles muy elevados de IgE [30]. En otro estudio, cuando los ratones fueron inmunizados con la proteína recombinante FBA de Schistosoma mansoni, desarrollaron altos niveles de IgG o IgG1 [31]. Un resultado similar ocurrió en el presente estudio. En comparación con el grupo de control, el nivel de anticuerpos en el grupo rHlFBA aumentó significativamente el séptimo día después de la segunda inoculación hasta la tercera inoculación (P < 0,05). Por tanto, se puede concluir que la inmunización con la proteína rHlFBA puede inducir a los conejos a producir inmunidad humoral.

Otros estudios también han demostrado la eficacia protectora de FBA contra varios desafíos de parásitos [31, 32]. Los ratones vacunados con rTsFBA mostraron una reducción del 48,7 % en la carga de gusanos adultos y una reducción del 52,5 % en la carga de larvas musculares [30]. Estos datos mostraron que TsFBA es un antígeno eficaz para desarrollar una vacuna contra la infección por T. spiralis. Marqués et al. vinculó el gen de S. mansoni FBA en el plásmido pGEX-4 T-3 y su proteína de fusión se produjo en E. coli [31]. La inmunización de ratones con este antígeno indujo una protección significativa (57%) contra la infección por cercarias y la formación de granulomas hepáticos disminuyó significativamente [31]. La FBA de S. mansoni adulto también reduce la formación de granulomas hepáticos de S. mansoni en ratones inmunizados. La FBA juega un papel central en la glucólisis y es importante para la producción de la energía necesaria para las diferentes actividades y la supervivencia de los esquistosomas, por lo que se ha convertido en un objetivo de intervención [33,34,35]. Estos hallazgos respaldan el uso de FBA como una vacuna candidata prometedora contra los parásitos. Nuestro análisis estadístico mostró que la eficiencia inmunológica de rHlFBA fue del 68,4%. En comparación con el grupo de control, el peso de la garrapata congestionada, la oviposición y las tasas de eclosión de huevos del grupo rHlFBA disminuyeron significativamente en un 22,6 %, 45,6 % y 24,1 %, respectivamente (P < 0,05). Un estudio anterior mostró que los anticuerpos en la sangre del huésped pueden cruzar el intestino medio de Rhipicephalus appendiculatus y retener la actividad de unión dentro de la hembra adulta [36]. Se puede plantear la hipótesis de que el anticuerpo puede unirse a la proteína HlFBA en la garrapata y mediar en la pérdida de la función FBA. Esto daría como resultado que la garrapata no obtenga energía de manera normal. Esta pérdida de energía podría manifestarse por la reducción del peso de la garrapata congestionada, la oviposición y las tasas de eclosión de los huevos de las garrapatas H. longicornis.

En un estudio anterior, encontramos que la protección inmunitaria de la triosafosfato isomerasa (TIM) en H. longicornis (HlTIM) era del 50,8 % [23]. El presente estudio indicó que la eficacia vacunal de HlFBA (68,4%) es superior a la de HlTIM. Los títulos de anticuerpos más altos se correlacionan con la protección del huésped contra las infestaciones por garrapatas [37]. Esta conclusión fue confirmada por el mayor nivel de anticuerpos del grupo HlFBA de los resultados de ELISA en nuestros estudios. Por lo tanto, las tasas de reducción de tres parámetros (peso de la ingurgitación, oviposición, incubabilidad) en el grupo HlFBA (22,6 %, 45,6 % y 24,1 %) fueron más altas que las del grupo HlTIM (8,6 %, 35,4 % y 17,3 %). Además, las funciones fisiológicas de los antígenos FBA y TIM fueron diferentes, y el grado de daño funcional mediado por anticuerpos fue diferente. Nuestros resultados mostraron que el gen FBA está altamente conservado en muchas especies de garrapatas y que esto sería beneficioso para el desarrollo de una vacuna antigarrapatas de amplio espectro. La reactividad cruzada de esta proteína con otros sueros derivados de garrapatas y los experimentos de inmunización relacionados deben analizarse para evaluar su viabilidad para el desarrollo de vacunas.

La proteína rHlFBA puede proteger particularmente a los conejos contra la infección por H. longicornis. La vacunación con FBA de un solo antígeno puede inhibir las respuestas fisiológicas en las garrapatas, afectar el desarrollo normal de la garrapata hembra y proteger al huésped. El estudio de las enzimas involucradas en el metabolismo de la glucosa podría ayudar a impulsar el desarrollo de una vacuna de amplio espectro contra las garrapatas.

Los datos que respaldan las conclusiones de este artículo se incluyen dentro del artículo.

Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas

Fructosa-1,6-bifosfato aldolasa

FBA de Haemaphysalis longicornis

Peroxidasa de rábano picante

Isopropil-β-d-1-tiogalactopiranósido

Marco de lectura abierto

difluoruro de polivinilideno

PCR cuantitativa en tiempo real

Proteína HlFBA recombinante

TBS-Tween-20

tiorredoxina

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Agradecemos a Hui Wang de la Facultad de Ciencias de la Vida de la Universidad Normal de Hebei, por su excelente asistencia técnica.

Este estudio fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de Hebei (C2021205010) y la Fundación de la Universidad Normal de Hebei (L2020Z06).

Yuan-Yuan Cao y Shu-Wen Xiao contribuyeron igualmente a este trabajo.

Laboratorio Clave de Biología Molecular y Celular del Ministerio de Educación, Laboratorio Clave de Fisiología Animal, Bioquímica y Biología Molecular de Hebei, Centro de Innovación Colaborativa para el Medio Ambiente de Hebei, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Normal de Hebei, Shijiazhuang, 050024, China

Yuan-Yuan Cao, Shu-Wen Xiao, Feng Yang, Xiao-Ya Liu, Hui Lu y Yong-Hong Hu

Colegio Técnico de Correos y Telecomunicaciones de Shijiazhuang, Shijiazhuang, 050021, China

Jin Cheng Zhang

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

YHH planeó y organizó el estudio y escribió la versión final. YYC SWX y redactó el manuscrito. YYC, FY y XYL realizaron los experimentos y el análisis de datos. HL y JCZ recolectaron muestras, participaron en la alimentación de garrapatas. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Yong-Hong Hu.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad Normal de Hebei por cumplir con la ley de protección animal de la República Popular China.

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

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Reimpresiones y permisos

Cao, YY., Xiao, SW., Yang, F. et al. Caracterización molecular y eficacia inmunológica de la fructosa-1,6-bifosfato aldolasa de Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Vectores de parásitos 16, 169 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05794-1

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Recibido: 29 enero 2023

Aceptado: 02 mayo 2023

Publicado: 25 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05794-1

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