Potencial de biocontrol de aislamientos nativos de Beauveria bassiana contra el gusano de la hoja del algodón Spodoptera litura (Fabricius)

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8331 (2023) Citar este artículo

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Se informa que el hongo entomopatógeno (EPF), Beauveria bassiana, es el agente de control biológico más potente contra una amplia gama de familias de insectos. Este estudio tuvo como objetivo aislar y caracterizar la B. bassiana nativa de varios hábitats del suelo en Bangladesh y evaluar la bioeficacia de estos aislamientos contra una importante plaga de insectos vegetales, Spodoptera litura. Siete aislamientos de suelos de Bangladesh se caracterizaron como B. bassiana mediante análisis genómico. Entre los aislamientos, TGS2.3 mostró la tasa de mortalidad más alta (82 %) frente a las larvas de S. litura en el segundo estadio a los 7 días después del tratamiento (DDT). Este aislado se sometió a más bioensayos frente a diferentes etapas de S. litura y encontró que TGS2.3 indujo una mortalidad general del 81, 57, 94, 84, 75, 65 y 57 % en el huevo, 1.°, 2.°, 3.°, 4.° y 5.° neonatales. larvas en estadio, respectivamente, más de 7 DDT. Curiosamente, el tratamiento con B. bassiana aislado TGS2.3 dio como resultado deformidades de pupas y adultos, así como una disminución de la aparición de adultos de S. litura. En conjunto, nuestros resultados sugieren que un aislado nativo de B. bassiana TGS2.3 es un posible agente de control biológico contra la plaga de insectos destructiva S. litura. Sin embargo, se necesitan más estudios para evaluar la bioeficacia de este aislado nativo prometedor en condiciones de planta y campo.

La reducción de las pérdidas de cultivos a causa de los insectos se está convirtiendo en un desafío mayor para la producción mundial de alimentos. Debido a las preocupaciones sobre su impacto en la salud humana, el medio ambiente y la cadena alimentaria, muchos de los insecticidas químicos más antiguos y menos costosos ya no están registrados1. Se están utilizando nuevas tecnologías, como productos químicos caros y más selectivos y modificación genética, pero esta mayor presión de selección acelera la evolución de la resistencia en las plagas de insectos. La agricultura mundial necesita urgentemente técnicas de manejo de plagas más respetuosas con el medio ambiente.

La oruga del tabaco, Spodoptera litura (Fabricius) (Lepidoptera: Noctuidae), es una de las plagas más devastadoras de 120 plantas de cultivo, incluidas la coliflor, el maní, el algodón, las cebollas, los tomates, la berenjena, los nabos y la col2. Cada año, pasa de cinco a seis generaciones superpuestas, y si no se trata a tiempo, puede causar pérdidas significativas de cultivos hasta la destrucción total3. Los insecticidas son el método más utilizado para controlar este problema. Aunque esto es eficaz para reducir las poblaciones de plagas a corto plazo, la exposición a largo plazo a los insecticidas puede hacer que S. litura desarrolle problemas de las 3 R, a saber, resistencia, reaparición de insectos y residuos en los cultivos, al igual que otros miembros de Noctuidae4. Además, el uso de plaguicidas conduce a desequilibrios ecológicos al destruir organismos no objetivo y sus enemigos naturales, parásitos y depredadores. La creciente preocupación del público por los posibles riesgos ecológicos y para la salud de los pesticidas sintéticos ha cambiado el enfoque de la investigación hacia métodos más benignos para el medio ambiente para controlar las plagas de insectos5.

Los hongos patógenos de insectos o entomopatógenos (EFP) (Hongos: Ascomycota, Orden: Hypocreales) causan enfermedades en los insectos. Estos entomopatógenos se utilizan como agentes de biocontrol, o "biopesticidas", para el manejo de plagas de insectos6. Brindan una alternativa a los insecticidas químicos para proteger los cultivos7 y reducir los impactos ambientales dañinos de los insecticidas químicos8. Un número creciente de productos basados en EPF están siendo registrados como insecticidas y utilizados en países desarrollados y en vías de desarrollo como Estados Unidos de América, Reino Unido, Australia, Canadá, China, India, etc.8.

Entre los miembros del género Hypocreales, Lecanicillium sp., Beauveria sp. y Metarhizium sp. se han utilizado eficazmente para controlar pulgones, larvas de lepidópteros y otras plagas9. Entre ellos, Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin es responsable de causar la enfermedad de la muscardina blanca en una variedad de insectos. Beauveria infecta al insecto al degradar la cutícula del huésped usando fuerzas mecánicas y químicas, que son particularmente ventajosas en el control de plagas porque los insectos no necesitan la ingestión directa de propágulos fúngicos, por lo que también se vuelve activo contra las etapas de no alimentación de los insectos10. Además, entre las micotoxinas hexadepsipeptídicas cíclicas producidas por los diferentes EPF, la beauvericina, producida por B. bassiana, ha mostrado las propiedades larvicidas más efectivas11.

Al igual que otros Hypocreales, las especies de Beauveria muestran etapas de vida pleomórficas. A menudo se los describe como hongos crípticos, es decir, las características morfológicas cambian en respuesta al medio ambiente y, por lo tanto, la descripción morfológica no aclara su sistemática a nivel de especie12. Hoy en día, los investigadores están utilizando técnicas moleculares basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para reconstruir la filogenia de Beauveria para una identificación precisa de las especies de Beauveria. Entre los marcadores moleculares, la región del espaciador transcrito interno (ITS) del ADNr se considera un código de barras universal para la identificación de hongos13. Pero en el caso de Hypocreales, el análisis ITS produjo baja resolución en muchos casos y no pudo resolver la filogenia de Beauveria14. Se necesitan marcadores genómicos adicionales como el factor de elongación de la traducción-1α (TEF) para que la determinación a nivel de especie de Beauveria se realice correctamente14.

Aunque B. bassiana mostró un amplio espectro de patogenicidad contra una amplia gama de insectos, su bioeficacia depende de la fuente de aislamiento y las etapas de vida de las etapas objetivo. Los problemas de resistencia y resurgimiento de los insecticidas se pueden abordar de manera efectiva controlando las plagas de insectos con aislamientos locales de hongos15. Estos aislamientos nativos también tienen una mayor capacidad de supervivencia y persistencia en las condiciones ambientales locales16. En las pautas de agricultura de conservación, también es importante aislar los bioagentes nativos potenciales para evitar la contaminación con bioplaguicidas importados. Además, la patogenicidad del agente de biocontrol difiere según las diferentes etapas de vida del insecto objetivo17. La identificación de la etapa más sospechosa de los insectos contra el inóculo fúngico aumenta la bioeficacia de las estrategias de control biológico en condiciones de campo. Por lo tanto, la presente investigación se llevó a cabo para aislar y caracterizar molecularmente aislados nativos de Beauveria y probar su bioeficacia frente a diferentes etapas de vida de S. litura.

Entre los aislamientos de hongos aislados en medio selectivo, siete aislamientos mostraron características de la morfología de las especies de Beuaveria. Las colonias fúngicas individuales de los aislamientos eran de color blanco, redondas, ligeramente elevadas con apariencia de polvo y ligeramente vellosas con anillos circulares. Los conidios eran hialinos y redondos. Los conidióforos de una sola célula eran cortos, densamente agrupados y hialinos (Fig. 1).

Características morfológicas de un aislado representativo de Beauveria TGS2.3. (a) Cultivo de 15 días, (b) Conidióforo con conidios.

Los conjuntos de datos de secuencia parcial de ITS y TEF se procesaron y analizaron individualmente a través del software Geneious V.11, y los números de acceso se obtuvieron de NCBI (Tabla 1). Los datos genómicos de ITS y TEF de siete aislamientos aislados de Beauveria mostraron similitud BLAST, con muchas referencias a B. bassiana en los resultados de búsqueda BLAST en la base de datos NCBI. El árbol filogenético de máxima verosimilitud reconstruido del conjunto de datos ITS mostró que los siete aislados morfológicamente característicos se agruparon con el aislado de referencia B. bassiana con un valor moderado de soporte de arranque (60%) (Fig. 2). Además, un árbol construido con el conjunto de datos TEF mostró el apoyo máximo (100 %) para el clado que contenía aislamientos aislados de Beauveria y referencias a B. bassiana (Fig. 3). Por lo tanto, tanto los conjuntos de datos ITS como TEF confirmaron que las cepas aisladas eran B. bassiana.

Árbol filogenético de máxima verosimilitud del conjunto de datos ITS de 1000 réplicas de arranque en el modelo GTR-GAMMA.

Árbol filogenético de máxima verosimilitud del conjunto de datos TEF de 1000 réplicas de arranque en el modelo GTR-GAMMA.

El crecimiento micelial medio general reveló que el aislado fúngico TGS2.3 (388,27 ± 10,29 mg/100 ml) exhibió la producción de biomasa más alta, y el crecimiento más bajo se observó en TGS1.2 (208,8 ± 8,03 mg/100 ml) (Fig. 4 ).

Producción de biomasa de los aislados de B. bassiana en caldo líquido SDA. Los valores (medias ± EE) con letra(s) alfabética(s) diferente(s) muestran diferencias estadísticamente significativas (lsd, p < 0,05).

Siete días después de la infección del segundo estadio larvario por siete aislamientos de B. bassiana, se reveló que TGS2.3 tenía las tasas de mortalidad más altas (81,72 ± 2,15 %), seguido de TGS2.1 (72,40 ± 3,46 %), BeauD1 (61,29 ± 1,08 %). , BeauA1 (51,61 ± 2,15 %), KSS1.1 (49,46 ± 4,69 %), TGS1.2 (46,59 ± 2,71 %) y KSS2.2 (43,73 ± 3,78 %) (fig. 5).

Tasas de mortalidad de larvas de segundo estadio de S. litura tratadas con aislamientos de Beauveria. Valores (medias ± SEs) con diferente letra alfabética muestran diferencias estadísticamente significativas (lsd, p < 0,05).

Los hallazgos implicaron que la muerte de las larvas de segundo estadio de S. litura tratadas con TGS2.3 y TGS2.1 ocurrió principalmente durante los primeros dos días de infección, especialmente en el primer día para TGS2.3. La mortalidad fue causada más gradualmente desde el día uno hasta el día siete por los otros aislados de Beauveria, a saber. BeauA1, BeauD1, KSS1.1, KSS1.2, KSS2.2 y TGS1.2 (Fig. 6).

Tasas de mortalidad acumulada de S. litura tratada con aislamientos de B. bassiana durante 7 días.

Dado que el primer día fue cuando se produjeron la mayoría de las muertes, los resultados se analizaron estadísticamente para determinar qué aislamientos indujeron la mayor mortalidad el día uno (causando una alta mortalidad dentro de las 24 h posteriores a la infección). Las muestras infectadas con TGS2.3 (56,67 ± 7,02 %) tuvieron la mayor mortalidad el primer día, seguidas por TGS2.1 (43,33 ± 3,51 %) (Fig. 7).

Mortalidad del primer día de larvas de segundo estadio de S. litura tratadas con aislamientos de B. bassiana. Los valores (medias ± EE) con letra(s) alfabética(s) diferente(s) muestran diferencias estadísticamente significativas (lsd, p < 0,05).

La incubabilidad de los huevos se redujo drásticamente en los huevos tratados con TGS2.3 en comparación con el control. El aislado TGS2.3 indujo una mortalidad de huevos de 81,25 ± 2,75 %, mientras que en el control fue de 18,5 ± 2,65 % (Fig. 8). Los datos posteriores al tratamiento de 7 días también revelaron que TGS2.3 indujo una mortalidad de larvas neonatales del 57,25 ± 6,34 %, mientras que en el control fue del 8,25 ± 2,63 % (Fig. 9).

Mortalidad de huevos de S. litura infectados con B. bassiana aislado TGS2.3. Valores (medias ± SEs) con diferente letra alfabética muestran diferencias estadísticamente significativas (lsd, p < 0,05).

Mortalidad de larvas en estadio neonato tratadas con TGS2.3 en estadio de huevo. Valores (medias ± SEs) con diferente letra alfabética muestran diferencias estadísticamente significativas (lsd, p < 0,05).

Las larvas tratadas con el aislado TGS2.3 sucumbieron a la infección por hongos y mostraron diferentes tasas de mortalidad en varios estadios larvarios. La mayor mortalidad se registró en larvas de primer estadio (94,45 ± 4,60 %) y la más baja en larvas de quinto estadio (56,56 ± 2,07 %). Las tasas de mortalidad en las larvas de tercer y cuarto estadio fueron estadísticamente similares (Fig. 10).

Tasas de mortalidad de diferentes estadios larvarios de S. litura tratados con el aislado de B. bassiana TGS2.3. Los valores (medias ± EE) con letra(s) alfabética(s) diferente(s) muestran diferencias estadísticamente significativas (lsd, p < 0,05).

La mortalidad acumulada durante 7 días demuestra que las larvas de primer estadio tuvieron la mayor mortalidad el día uno, que aumentó progresivamente hasta el cuarto día. La muerte de las larvas de segundo estadio comenzó el día uno y posteriormente aumentó hasta el día cinco. Las larvas del tercer estadio no murieron hasta el tercer día y la tasa de mortalidad progresó hasta el sexto día. La muerte de las larvas en el 4° y 5° estadio ocurrió el 4° día y posteriormente aumentó hasta el 7° día (Fig. 11). En general, la mortalidad en varios puntos de tiempo reveló que todos los estadios larvarios de S. litura eran susceptibles al hongo TGS2.3.

Mortalidad acumulada de diferentes estadios larvarios de S. litura tratados con B. bassiana aislado TGS2.3.

Se redujo la movilidad de las larvas infectadas. Las larvas estaban tiesas y rígidas después de morir. Dos días después de la muerte, las larvas fallecidas comenzaron a producir micelio. (Figura 12). La infección por B. bassiana fue verificada por los portaobjetos preparados a partir del crecimiento de este hongo. En comparación con las larvas de control, B. bassiana tuvo un impacto negativo en la aparición de adultos de los estadios 2, 3, 4 y 5. Un número menor de adultos (7,11–37,94 %) emergió de las larvas tratadas con hongos que de las larvas de control (94 %) (Fig. 13).

Cadáver larval de S. litura micoseado por B. bassiana aislado TGS2.3.

Emergencia adulta de larvas de S. litura debido al tratamiento con B. bassiana aislado TGS2.3. Valores (medias ± SEs) con diferente letra alfabética muestran diferencias estadísticamente significativas (lsd, p < 0,05).

La infección por hongos causó una amplia gama de anomalías. Cuando algunas de las larvas tratadas mudaron a pupas, no se separaron por completo del exuvium (Fig. 14). Algunas pupas carecían de una cutícula completamente desarrollada. Cuando las larvas de segundo estadio fueron tratadas con B. bassiana, tenían 9,33 ± 2,08 por ciento de deformidades de pupa. De manera similar, la deformidad pupal fue de 7,67 ± 1,53, 10 ± 2 y 6,67 ± 1,53 por ciento debido al tratamiento de larvas de 3.°, 4.° y 5.° estadio, respectivamente (Fig. 15). Los adultos desarrollados a partir de larvas infectadas por hongos tenían deformidades del 3,67 al 10% (Fig. 16) con alas plegadas y sin desarrollar (Fig. 17). El grupo de control, sin embargo, no mostró deformación.

Adulto no desprendido de exuvium.

Deformidad pupal de larvas de S. litura debido al tratamiento con B. bassiana aislada TGS2.3. No se observó diferencia estadísticamente significativa entre los valores (medias ± SEs) (lsd, p < 0,05).

Deformidad adulta de larvas de S. litura debido al tratamiento con B. bassiana aislado TGS2.3. Valores (medias ± SEs) con diferente letra alfabética muestran diferencias estadísticamente significativas (lsd, p < 0,05).

(a) Pupas normales, (b) Pupas deformadas, (c) Adulto normal, (d) Adulto deformado.

La oruga del tabaco (S. litura) es una de las plagas más devastadoras de varios cultivos. Los insecticidas son el método más utilizado para controlar este problema. El uso de pesticidas conduce a desequilibrios ecológicos al destruir organismos no objetivo y sus enemigos naturales, parásitos y depredadores. La creciente preocupación del público por los posibles riesgos ecológicos y para la salud de los pesticidas sintéticos ha cambiado el enfoque de la investigación hacia métodos más benignos para el medio ambiente. Entre ellos, B. bassiana causa la enfermedad de la muscardina blanca en una amplia variedad de insectos. Los problemas de resistencia y resurgimiento de los insecticidas se pueden abordar de manera efectiva controlando las plagas de insectos con aislamientos locales de hongos y enfocándose en las etapas más sospechosas de los insectos.

En este estudio, se aislaron siete aislamientos de B. bassiana de muestras de suelo y se informaron por primera vez en Bangladesh como aislamientos locales. La morfología descrita por estudios previos5,18.fue similar a la de nuestros siete aislados. La filogenia ITS produjo un valor de soporte moderado para estos siete aislamientos, lo que confirmó la insuficiencia del análisis ITS que se había informado previamente1,14,19. Sin embargo, ITS podría usarse para la detección rápida de una amplia gama de aislamientos de campo debido a su eficiencia de amplificación por PCR20,21,22 y la disponibilidad de datos de referencia23. El análisis molecular adicional con datos de TEF apoyó la posición filogenética de siete aislamientos en el clado de B. bassiana con mucha fuerza y demostró su eficacia en la resolución de filogenias para hongos Hypocreales1,14,19.

Para encontrar el mejor aislado patógeno de insectos B. bassiana, se investigó la mortalidad general y diaria de las larvas de segundo estadio para determinar la mortalidad inducida por cada aislado fúngico. La tasa de mortalidad más alta fue inducida por el aislado de B. bassiana TGS2.3 y podría deberse a propiedades patogénicas de insectos más altas, como la adhesión conidial, la tasa de germinación, las condiciones de crecimiento o la producción de enzimas o metabolitos secundarios. La primera etapa de la infección fúngica es la unión conidial, y la fuerza de la unión conidial es un indicador crucial de la virulencia de un hongo entomopatógeno. La unión de las células fúngicas a la cutícula puede involucrar un receptor-ligando específico y/o mecanismos hidrofóbicos y electrostáticos no específicos24,25,26. Si la fuerza de adhesión de EPF se debilita, podría resultar en el lavado de las conidias del huésped, previniendo así la infección27. La fluctuación de virulencia entre diferentes aislados de B. bassiana puede deberse a sus diferentes niveles de naturaleza hidrofóbica oa su bioquímica.

La síntesis de metabolitos secundarios podría permitir que EPF supere las defensas inmunológicas de los insectos y acelere la micosis6. Según algunas investigaciones, EPF B. bassiana crea metabolitos secundarios específicos del huésped que, en cantidades bajas, pueden provocar una mortalidad del 50 %11,28. La cepa TGS2.3, que mostró la mayor tasa de mortalidad de insectos, puede producir compuestos biológicamente activos con actividad insecticida contra S. liturta. Se requiere más investigación para determinar los compuestos bioactivos producidos por el aislado TGS2.3 de B. bassiana. La investigación y producción de estos compuestos puede abrir nuevas posibilidades para el control de plagas invasoras de cultivos.

Los parámetros, como la germinación conidial y la producción de enzimas hidrolíticas están asociados con la virulencia de EPF21,29,30,31. Se encontró que una tasa de germinación más rápida exhibió una mayor virulencia en B. bassiana29. La mortalidad del día uno de TGS2.3 fue la más alta entre todos los aislamientos, lo que sugiere que TGS2.3 tiene una tasa de germinación más alta. Las enzimas hidrolíticas como la proteasa, la quitinasa y la lipasa son secretadas por EPF para degradar la cutícula de las especies huésped e infectarlas32. La mayor actividad enzimática puede ser una de las razones de la mayor virulencia de TGS2.3. Se necesita más investigación para verificar estas hipótesis para nuestro candidato de Beauveria de alto rendimiento, TGS2.3.

La inmovilidad de los huevos es la razón principal de la vulnerabilidad de los insectos a las infecciones microbianas33. El requerimiento de nutrientes de un huevo para convertirse en una cría es excesivo, y en esta etapa son el objetivo principal de los microbios patógenos34. Este estudio mostró que los huevos de S. litura eran altamente susceptibles a TGS2.3. Resultados similares se encontraron en estudios previos donde B. bassiana indujo la mortalidad de huevos en S. frugiperda35,36 y Phthorimaea operculella37. El aislado TGS2.3 también indujo mortalidad en larvas neonatas, similar a otro estudio realizado por Idrees et al.17.

La mortalidad de las larvas fue máxima en el 1er instar y disminuyó gradualmente con el avance de cada estadio. Las larvas de primer estadio experimentaron una mortalidad un 38 % mayor que las larvas de quinto estadio. Esto indica la disminución de la susceptibilidad de las larvas con la edad. Shweta y Simon38 usaron B. bassiana contra S. litura Fab. (Oruga del tabaco) en el que las larvas de 1er y 2do estadio mostraron mayor mortalidad que los estadios tardíos. Estas variaciones en la mortalidad entre varios estadios podrían atribuirse a la actividad enzimática. Según diferentes estudios, la actividad de las enzimas de desintoxicación cambia significativamente a lo largo y dentro de las etapas de desarrollo. La actividad es modesta en la etapa de huevo, aumenta con cada estadio larval o ninfal y finalmente disminuye a cero durante la pupa39,40.

El aislado EPF TGS2.3 demostró subletalidad durante las etapas de vida de S. litura. Se produjeron deformidades de pupas y adultos como consecuencia de la infección fúngica en el estado larvario. Las larvas no pudieron hacer una transición adecuada a pupas. Según los informes, la muda de insectos se ha visto obstaculizada por B. bassiana41. Dado que el desarrollo de nuevas cutículas durante el proceso de muda depende en gran medida de los nutrientes, cualquier etapa del proceso puede verse afectada si existe un desequilibrio nutricional en la hemolinfa causado por una infección por hongos. Esta subletalidad del aislado de B. bassiana TGS2.3 sugiere una influencia subletal relativamente prolongada de los hongos en S.litura, que puede reducir las poblaciones de S.litura de manera más eficaz además de la mortalidad directa.

En resumen, este estudio encontró que el aislado más potente, TGS2.3, fue efectivo contra la eclosión de huevos y todas las etapas de las orugas de S. litura y sugirió que este aislado fúngico podría utilizarse para atacar las etapas de eclosión y alimentación de este objetivo. insecto. Además, las primeras etapas del desarrollo larvario de S. litura fueron más susceptibles a la infección por hongos. Los efectos subletales también demostraron que, una vez expuesto a un entomopatógeno, el aislado TGS2.3 de B. bassiana tiene la capacidad de matar insectos en cualquier etapa de vida descendiente del insecto y reducir la aparición de adultos. Este estudio justifica una mayor evaluación in planta tanto en condiciones de laboratorio como de campo para evaluar con precisión la bioeficacia de los aislamientos nativos de B. bassiana. Sin embargo, los hallazgos de esta investigación proporcionaron el potencial para desarrollar técnicas alternativas de control de plagas de S. litura, así como para limitar el uso de pesticidas sintéticos, minimizando así sus efectos perjudiciales en el ecosistema.

Se obtuvieron muestras de suelo del bosque Bhawal Sal y campos agrícolas en Gazipur, Bangladesh. Para construir la muestra compuesta, se mezclaron cinco muestras de suelo diferentes con un peso total de 250 a 300 g desde una profundidad de 10 a 15 cm utilizando un muestreador de suelo. Hasta que se estudiaron todas, las muestras de suelo se guardaron en distintas bolsas zip-lock con etiquetas y se mantuvieron a 4 °C en una cámara frigorífica.

Se preparó una suspensión de suelo que contenía cinco gramos de suelo y 50 ml de Tween 80 al 0,1 % en un tubo de plástico con tapón de rosca y se incubó a temperatura ambiente durante 3 h después de pasar por un tamiz de 5 mm. Se realizaron cinco inversiones de cada tubo a intervalos de 30 min. Los tubos se mantuvieron durante 20 s después de la incubación para permitir la sedimentación, y 100 µL del sobrenadante de cada tubo se sembró en una placa de Petri con medio Sabouraud dextrosa agar (SDA) (peptona 10 g/L, agar 10 g/L, dextrosa 40 g/L y CTAB 60 mg/L). Para evitar la contaminación bacteriana, también se agregó estreptomicina (30 mg/L). Después de la inoculación, todas las placas se sometieron a un período de incubación de dos semanas a 22 °C. Cada 2 o 3 días, las placas se revisaron en busca de un desarrollo de micelio blanco compacto, grueso y reconocible. Se aislaron y subcultivaron aislados de tipo hipocreales.

Tanto las estructuras vegetativas como reproductivas de las colonias fúngicas en SDA se examinaron usando microscopía inmediatamente después de la esporulación. Desde la parte más externa de la colonia fúngica, se transfirieron pequeñas placas a portaobjetos de vidrio y se inspeccionaron con un microscopio óptico compuesto.

En placas de agar SDA sin antibióticos, los hongos aislados se subcultivaron para el aislamiento y la secuenciación del ADN. Para la extracción del ADN se utilizó el procedimiento descrito por Islam1.

Brevemente, se colocó un pequeño trozo de micelio fúngico de un cultivo de 7 días en un tubo Eppendorf, se machacó con un mortero de plástico estéril y luego se suspendió en 1 ml de tampón de lisis (400 mM Tris-HCl, pH 8,0, 60 EDTA mM, NaCl 150 mM y SDS al 1 %), que luego se incubó a 50 °C durante 1 h en un bloque de calor. Se añadió un volumen de 150 μL de tampón de precipitación (acetato de potasio 5 M, 60,0 mL; ácido acético glacial, 11,5 mL; agua destilada, 28,5 mL) en el tubo y se agitó brevemente, luego se incubó en hielo durante 5 min. El sobrenadante de la centrifugación se transfirió a un tubo nuevo junto con 500 ml de isopropanol para precipitar el ADN. Después de la centrifugación a 18.000 rcf durante 20 min, el sedimento de ADN se recuperó y se lavó con 1 ml de etanol al 70 %. Después de secarse al aire durante diez minutos, el sedimento de ADN se disolvió en 100 µl de tampón Tris-EDTA (TE). En una nanogota, se examinó la pureza del ADN. Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar la región ITS utilizando los cebadores ITS1F: CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA e ITS4R: TCCTCCGCTTATTGATATGC de acuerdo con el perfil: desnaturalización a 90 °C durante 2 min, luego 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 seg. , recocido a 55 °C por 30 segundos, extensión a 72 °C por 1 min y finalmente extensión a 72 °C por 15 min1. La región 5′-TEF se amplificó usando EF1TF (5′-ATGGGTAAGGARGACAAGAC) y EF2TR (5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT) después de que el perfil se sometiera a una desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, seguida de 35 ciclos a 94 °C durante 40 s , 65 °C por 40 s, 72 °C por 2 min y una extensión final a 72 °C por 10 min19. El producto de PCR se sometió a electroforesis en agarosa al 1 % en tampón TBE 1 × a 120 V con tinción de ácido nucleico GelRed y se fotografió con un generador de imágenes moleculares bajo luz ultravioleta. Para la secuenciación, los productos de PCR se enviaron a Macrogen, Corea.

Se generaron los datos de secuenciación de Sanger de los aislados fúngicos y se completó una búsqueda BLAST en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Los conjuntos de datos de secuencias parciales de ITS y TEF se enviaron al NCBI para obtener el número de acceso. Las secuencias coincidían con las secuencias del genoma de referencia obtenidas de NCBI. El complemento MAFT de Geneious V.11 se usó para múltiples alineaciones y la alineación final se arregló manualmente. Los árboles filogenéticos se desarrollaron mediante análisis de máxima verosimilitud para los conjuntos de datos utilizando el complemento Geneious V.11 RAxML utilizando un arranque rápido y buscando el árbol ML de mejor puntuación de 1000 réplicas de arranque en el modelo GTR-GAMMA.

Los huevos de S. litura se obtuvieron del cultivo existente en la División de Entomología, Instituto de Investigación Agrícola de Bangladesh (BARI), Gazipur, Bangladesh. Se obtuvieron larvas homogéneas de huevos eclosionados el mismo día. Las larvas se cultivaron en cajas de plástico estériles que contenían trozos de okra desinfectadas con hipoclorito de sodio al 0,5 % (v/v) durante 10 min, mantenidas a 25 ± 2 °C y 65 ± 5 % de HR42.

En este estudio se utilizó medio de agar dextrosa de Sabouraud (SDA). Se colocó individualmente un cultivo de B. bassiana de crecimiento activo de 10 mm en el centro de la placa de Petri de 60 mm que contenía 10 ml de medio SDA sólido43. Las placas inoculadas se incubaron a 28 ºC durante 7 días. A continuación, se preparó la suspensión de conidios de los aislados inundando las placas con 10 ml de Tween 80 estéril (0,05 %), se raspó suavemente la superficie del agar con varillas de vidrio estériles y se recogió la suspensión en vasos de precipitados estériles de 250 ml. Luego se ajustó la suspensión a 50 mL y se mezcló con una batidora manual para separar y dispersar las conidias, y finalmente se ajustó la densidad de conidias a 1,5 × 108 conidias por ml con un hemocitómetro44. Antes del experimento de bioensayo, se probó la germinación de conidios en medio de agar SDA.

Se preparó un volumen de 250 mL de Caldo Dextrosa Sabouraud (SDB) en un frasco Schott de 500 mL y el pH final se ajustó a 6,5. A continuación, los caldos líquidos se inocularon con un disco de cultivo del hongo de 10 mm. Se mantuvieron tres repeticiones para todos los aislamientos de B. bassiana. Todo el montaje se mantuvo en una incubadora con agitación a una temperatura de 25 °C a 120 rpm durante 10 días. Se observó un crecimiento tipo bola de algodón blanco después de 7 días. Posteriormente, los micelios se filtraron a través de un papel filtro previamente pesado y se secaron en una estufa de aire caliente a 70 °C hasta obtener un peso constante. Esto reveló la capacidad de producción de biomasa de todos los hongos aislados 43.

Las masas de huevos recién puestos que tenían 1 o 2 días de edad se recolectaron y contaron bajo un microscopio de disección. Se separó un lote de 50 huevos usando un cepillo para el cabello y se transfirió a una placa de Petri. Se preparó un volumen de 10 ml de suspensión de conidias (1,5 × 108 conidios/ml) usando Tween 80 al 0,05 %. Luego, la suspensión se roció sobre las masas de huevos. Para el control, solo se utilizó Tween 80. Cada tratamiento se repitió cuatro veces. 7 días después del tratamiento (DDT), se contó el número de huevos eclosionados y no eclosionados. Luego, las larvas recién nacidas se alimentaron, se incubaron a 25 ± 2 °C y se monitorearon durante los siguientes 7 días. La mortalidad de cada tratamiento fue cuidadosamente registrada17.

Los huevos recién puestos se recogieron y eclosionaron para obtener larvas homogéneas. El ensayo se realizó en larvas de segundo estadio de S. litura. Un conjunto de 10 larvas por triplicado se sumergieron individualmente en una suspensión de conidios de 10 mL de aislamientos de Beauveria (1,5 × 108 conidios/mL) durante 5 s. Después del tratamiento, transfirió cada conjunto de larvas a una caja de plástico estéril separada. A cada caja, se agregó papel secante húmedo y un trozo de okra desinfectada como alimento. Cambiamos el papel y el pienso en días alternos. A los 7 DDT se registró la mortalidad de larvas según los aislamientos42.

Las larvas que sobrevivieron al tratamiento con hongos se criaron más hasta la pupa a 25 ± 2 °C y 60–70 % de humedad relativa para ver la actividad subletal, como la variación en el desarrollo, cualquier tipo de deformidad y longevidad en comparación con el control. Se realizaron observaciones sobre la deformidad de larvas y pupas, la emergencia de adultos y cualquier deformidad morfológica en varias etapas de desarrollo3.

La mortalidad fue corregida por la fórmula de Abbott45. Los datos porcentuales se transformaron mediante la transformación arcoseno. Los datos se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA), seguido de una comparación de las medias de diferentes tratamientos utilizando la diferencia mínima significativa (LSD). Los análisis se realizaron utilizando R versión 3.4.2.

Los datos de secuencia parcial de las regiones genómicas ITS y TEF de aislamientos fúngicos durante el estudio actual están disponibles en el depósito del NCBI con los números de acceso OP784778–OP784784 y OP785280–OP785286 (estarán disponibles el 4 de diciembre de 2022), respectivamente. Los conjuntos de datos estadísticos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Descargar referencias

Esta investigación fue financiada por la Academia de Ciencias de Bangladesh bajo el programa de dotación BAS-USDA (4.ª fase BAS-USDA BSMRAU CR-13). Los autores también expresaron su agradecimiento a la División de Entomología, Instituto de Investigación Agrícola de Bangladesh (BARI), Gazipur, Bangladesh, por brindar apoyo para la recolección y crianza de huevos.

Instituto de Biotecnología e Ingeniería Genética, Universidad Agrícola Bangabandhu Sheikh Mujibur Rahman, Gazipur, Bangladesh

Shah Mohammad Naimul Islam, Maryland. Zahid Hasan Chowdhury, Mahjabin Ferdaous Mim y Tofazzal Islam

Capacitación en investigación de algodón y granja de multiplicación de semillas, Gazipur, Bangladesh

Milia Bente Momtaz

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SMNI conceptualizó la idea, los experimentos supervisados, escribió y editó el manuscrito. MZHC diseñó experimentos, analizó datos y escribió el manuscrito. MFM realizó un estudio molecular y de hongos, MBM realizó un bioensayo de insectos, TI contribuyó en la interpretación, revisó y editó el manuscrito. La correspondencia y las solicitudes de materiales deben dirigirse a SMNI o TI

Correspondencia con Shah Mohammad Naimul Islam o Tofazzal Islam.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Islam, SMN, Chowdhury, MZH, Mim, MF et al. Potencial de biocontrol de aislamientos nativos de Beauveria bassiana contra el gusano de la hoja del algodón Spodoptera litura (Fabricius). Informe científico 13, 8331 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35415-x

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Recibido: 29 noviembre 2022

Aceptado: 17 de mayo de 2023

Publicado: 23 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35415-x

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